[发明专利]一种桉树焦枯病原菌的双重PCR检测试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种桉树焦枯病原菌的双重PCR检测试剂盒，其特征在于，其包括：

(1)10×PCR Buffer；

(2)25mmol/L Mg²⁺；

(3)10mmol/L dNTP；

(4)引物：10mmol/L CYS1，10mmol/L CYS2，10mmol/L EF-S-1，10mmol/L EF-A-1；其中，引物序列为：CYS1：5＇－CCAGAGGACCCAACAAAC－3＇，CYS2：5＇－CCAGAGCGAGGTGTATTAC－3＇，EF-S-1：5＇－GCAAGAGTCGGATGGAAT－3＇，EF-A-1：5＇－TTGATTGACACTGTGCTAAC－3＇；

(5)5U/μL Tag聚合酶；

(6)ddH₂O。

2.根据权利要求1所述的桉树焦枯病原菌的双重PCR检测试剂盒的使用方法，其特征是，其步骤如下：

(1)提取纯培养菌株基因组DNA或所取植物组织样总DNA；

(2)反应体系50μL包含：10×PCR Buffer5.0μL，25mmol/L Mg²⁺ 3μL，10mmol/L dNTP1.5μL，10mmol/L CYS1 1.0μL，10mmol/L CYS2 1.0μL，10mmol/L EF-S-1 1.0μL，10mmol/L EF-A-1 1.0μL，5U/μL Tag聚合酶0.3μL，ddH₂O32.2μL，加(1)中纯培养菌株基因组DNA或所取植物组织样总DNA提取液4.0μL，组成反应混合液；

(3)PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40s，53℃退火35s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸10min；

(4)PCR产物的电泳检测：扩增结束后取5.0μL PCR产物上样于含0.5μg/mL EB的1.5％琼脂糖凝胶上电泳，电压为9V/cm、时间为30min，在凝胶成像系统上检测并拍照；如果存在分子量为197bp和351bp的双片段，则判定所述菌株中或植株组织样中存在桉树焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium。