[发明专利]一种桉树焦枯病原菌的双重PCR检测试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种桉树焦枯病原菌的双重PCR检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

桉树(Eucalyptus spp.)是世界三大速生造林树种之一，在我国生态环境建设以及解决生物能源问题中发挥着不可替代的作用，具有重要的经济、社会、生态效益。但目前，由桉树病原真菌所引起的桉树焦枯病严重影响着桉树材积量的生产，造成巨大的经济损失，极大地威胁着我国林业生产建设，其中在我国主要引起桉树焦枯病的病原真菌为Cylindrocladium scoparium。

桉树焦枯病原菌危害桉树叶片和枝梢，尤其是危害苗木和4年生以下的幼树，主要特征是叶片和嫩茎上有坏死性病斑。叶片感染初期出现针头状水渍小斑。病斑逐渐扩大为不规则的坏死状黄褐色病斑，坏死如被灼伤样，边缘的病斑有一褪绿赤褐色晕圈；后期病斑中部变浅色有轮纹状或不明显，多数叶缘的病斑连接。然后向中间发展，病叶部位脆易裂，形成典型烂叶症状。严重感病的苗木叶片全部脱落、顶枯。幼树感病后叶片由下而上脱落2/5-4/5，甚至全脱光秃，个别整株死亡。病原菌侵染枝条后，枝条表皮遍布近圆形或长条形的小褐斑，若病斑环绕小枝，枝条即干枯。在雨后或高湿环境，尤其靠近地面枝叶的坏死部分，出现密布白色点状物，其为病原苗的孢子堆。因此，探求快速、准确的检测桉树焦枯病原菌的有效方法是桉树焦枯病害防治的前提条件。

近年来，分子生物学技术迅速发展，真菌基因转录间隔区也大量被使用在真菌鉴定和分子检测体系中。真菌基因转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)，它首先由Gonzalez在1990年提出，随后逐步发展起来的全新的分子标记。ITS检测的优点在于：具有高拷贝数；同时包含保守与变异序列；能根据保守序列中的变异设定通用引物进行扩增比较。ITS是一种简单、快速、准确、灵敏度高、易于操作的分子标记技术，现在广泛应用于真菌的分类鉴定、病原菌的分子检测和病害诊断等研究中。由于ITS的序列分析对真菌属、种的分类具有稳定性，能实质性地反映同一属内不同种间及种内菌株间的序列差异，因此，ITS序列分析被广泛的应用到了真菌属种分类研究的领域中。分子检测的方法解决了传统方法只能依靠病原菌的形态学、致病性测定来检测病原菌，而无法做到的病害早期检测。对ITS序列的研究不仅能解决许多形态学分类研究中的疑难问题而且在对植物病原菌的检测和鉴定上起到了事半功倍的效果。此外，对于桉树焦枯病原菌分子检测技术国内在这方面的报道相对有限，因此努力加强研究桉树焦枯病原菌的分子检测也有助于生物学的全面发展。

传统真菌的鉴定主要是通过形态学和生理生化指标。形态学鉴定菌株是普遍采用的方法，但耗时、繁琐、需要较高的专业技术知识。形态学鉴定必须是在分离培养得到病原物的基础上才能开展，对有些培养条件特殊及形态结构不易区分的一些种的鉴定上显得非常困难，且真菌种类繁多、个体多态性明显，有些真菌在生长的过程中由于受到环境的压力，其形态特征和生理生化指标发生变化，使得其形态特征复杂化，从而给分类和检测带来困难和不准确性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在检测桉树焦枯病原菌中存在的不足，提供了一种桉树焦枯病原菌的双重PCR检测试剂盒及其使用方法。

本发明的技术方案如下：

一种桉树焦枯病原菌的双重PCR检测试剂盒，其包括：

(1)10×PCR Buffer；

(2)25mmol/L Mg²⁺；

(3)10mmol/L dNTP；

(4)引物：10mmol/L CYS1，10mmol/L CYS2，10mmol/L EF-S-1，10mmol/L EF-A-1；其中，引物序列为：CYS1：5＇－CCAGAGGACCCAACAAAC－3＇，CYS2：5＇－CCAGAGCGAGGTGTATTAC－3＇，EF-S-1：5＇－GCAAGAGTCGGATGGAAT－3＇，EF-A-1：5＇－TTGATTGACACTGTGCTAAC－3＇；

(5)5U/μL Tag聚合酶；

(6)ddH₂O。

所述的桉树焦枯病原菌的双重PCR检测试剂盒的使用方法，其步骤如下：

(1)提取纯培养菌株基因组DNA或所取植物组织样总DNA；