[发明专利]抗ALS抑制剂类除草剂菵草的PCR检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及抗除草剂杂草检测技术，具体地说，涉及一种抗ALS抑制剂类除草剂菵草的PCR检测方法及试剂盒。

背景技术

乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase,简称ALS)，也称乙酰羟酸合酶(acetohydroxyacid synthase，简称AHAS)，是诱导植物和微生物体内缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成过程中关键性酶，也是一种重要的除草剂靶标。ALS抑制剂类除草剂的开发及使用始于上世纪80年代初，由于此类除草剂有超高活性、对人及动物低毒、环境友好等明显的优势，受到广泛关注，目前已有50多个品种被开发和使用。上世纪80年代开始，我国长江中下游陆续在冬小麦田推广使用氯磺隆、甲磺隆、二甲碘磺隆、啶磺草胺等防除禾本科杂草，对控制菵草、日本看麦娘等禾本科杂草起到了非常重要的作用。但由于该类除草剂分子靶标单一，长期使用易引起杂草抗药性，近些年来，以常规剂量喷施甲基二磺隆、甲磺隆等除草剂无法有效防除菵草的问题在我国长江中下游的一些麦田非常突出，并且发现，有些麦田抗甲基二磺隆的菵草对啶磺草胺等ALS抑制剂也产生了交互抗性。麦田杂草对上述几种ALS抑制剂产生交互抗性，使这些农田不能继续使用该类除草剂，而在生产中由于农民对杂草抗药性的认识上的不足，盲目增大用药剂量，不仅增加了成本，使药害风险加大，严重影响农民收入和国家粮食安全。因此，目前迫切需要开发一种简便、快速的抗药性杂草检测鉴定方法。

我国抗药性杂草的研究起步较晚，传统的抗药性杂草检测通常采用室内生物测定法，既对田间采集的疑似抗性的杂草的种子在室内进行培养，在一定叶龄喷施除草剂后，调查株防效和地上部分生物量来计算抗性指数。这种方法能够客观地评价某种杂草对相应除草剂的抗性情况，但也有其局限性，主要表现在以下两方面：一是不能当季、当时进行检测，二是占地多、时间长、工作量大。随着分子生物学技术在杂草抗药性机理研究方面的应用，越来越多的杂草的抗药性机理得到明确。

目前已有的研究报道显示，对ALS抑制剂产生抗性的植物在其靶标酶ALS保守区共发现了8个SNP位点(http://www.weedscience.org/Mutations/MutationDisplayAll.aspx)，这些位点的任意一个位点氨基酸突变为其他氨基酸都使植物对相应除草剂产生抗性。这8个氨基酸位点目前公认以拟南芥ALS为标准标注位点，包括122、197、205、376、377、574、653、654位氨基酸(图3)。进一步研究发现，菵草(Beckmannia syzigachne(Steud.)Fernald)，对甲基二磺隆等ALS抑制剂类除草剂产生抗性的原因也是编码靶标酶ALS的保守区某一位点发生点突变引起的。因此，可以通过分子生物学手段检测其靶标酶ALS的保守区突变位点来检测菵草是否发生抗药性。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗ALS抑制剂类除草剂菵草的PCR检测方法。

本发明的另一目的是提供一种用于检测抗ALS抑制剂类除草剂菵草的试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于检测抗ALS抑制剂类除草剂菵草的特异性PCR引物组合，包括用于特异性扩增菵草ALS基因的引物对I和引物对II。这两对引物扩增的ALS片段包含目前在其他抗ALS抑制剂类除草剂的植物上发现的所有8个SNP位点。引物序列如下：

引物对I：

正向引物WC-ALS-ⅠF：5’-CGCCTTACCCAAACCTACT-3’

反向引物WC-ALS-ⅠR：5’-ATGCGGCTGCTTGTTCTT-3’

引物对II：

正向引物WC-ALS-ⅡF：5’-GATAAGGCTGACCTGTTGC-3’

反向引物WC-ALS-ⅡR：5’-TCACAGTTGACCACACTTC-3’

本发明还提供含有上述引物组合的用于检测抗ALS抑制剂类除草剂菵草的试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液等中的至少一种。

更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供一种抗ALS抑制剂类除草剂菵草的PCR检测方法，其利用上述引物组合或试剂盒检测抗ALS抑制剂类除草剂菵草。

前述方法，包括以下步骤：

1)提取样品中的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，进行PCR扩增反应；