[发明专利]一种构建高产5‑氨基乙酰丙酸大肠杆菌工程菌株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种构建高产5-氨基乙酰丙酸大肠杆菌工程菌株的方法，属于代谢工程和微生物发酵领域。 

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)，分子式为C₅O₃NH₉，分子量为131.13，熔点为149-151℃，它是生物体合成叶绿素、血红素、维生素B₁₂等的关键前体物质。ALA作为一种安全、选择、渗透性好的光动力学药物在医学领域逐渐受到重视，已经成功应用于皮肤癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的诊断和光动力治疗中。另外，ALA作为一种环境相容性及选择性很高的新型光活化农药，在农药领域应用非常广泛，如作为一种无公害的绿色农药、除草剂以及植物生长调节剂等。 

目前，ALA合成主要采用化学法合成，最早出现在上世纪50年代，直到20世纪90年代，相关研究才大量开展，并取得了一定的成绩。但是由于化学合成反应步骤繁琐，副产物多，分离提纯困难，ALA的得率也较低，并且环境污染严重等问题，近年来，微生物发酵生产ALA已成为研究的热点。自然界中，ALA的生物合成存在两条途径，一条是C4途径，由5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS，hemA编码)催化琥珀酰-CoA和甘氨酸生成ALA的一步酶促反应组成，主要存在于一些光合细菌、真菌以及动物体内。另外一条是C5途径，首先谷氨酸在谷氨酰-tRNA合成酶(GluRS，gltX编码)催化下，生成谷氨酰-tRNA，然后，谷氨酰-tRNA在谷氨酰-tRNA还原酶(GluTR，hemA编码)作用下生成谷氨酸-1-半醛(GSA)，最后GSA由谷氨酸-1-半醛-2,1-氨基转移酶(GSA-AM，hemL编码)催化生成ALA。该途径广泛存在于植物、藻类以及细菌(如大肠杆菌)中。 

早期，人们筛选到产ALA的光合细菌类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，通过诱变育种法对其进行诱变，筛选ALA的高产菌株，并通过发酵优化等使得ALA的产量达到7.2g/L。但由于光合细菌的特殊性，其成本较高，不适合大规模的工业化生产。目前以C4途径为基础的生物转化由于添加前体琥珀酸和甘氨酸生产ALA成本相对较高。 

本发明在系统阐述分析大肠杆菌中C5途径(图1)调控机制，及表达5-氨基乙酰丙酸C5合成途径关键酶基因hemL和hemA基础上，进一步表达来源于大肠杆菌血红素生物合成途径基因hemD及hemF，实现了ALA产量的进一步提高，且发酵周期明显缩短，降低了生产成本。 

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种高产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌株，其在表达C5途径关键基因hemL(编码谷氨醛氨基转移酶)和hemA(编码谷氨酰-tRNA还原酶)的基础上，共表达来源于大肠杆菌的尿卟啉原III合酶(hemD编码)和/或粪卟啉原III氧化酶(hemF编码)。 

所述hemL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

所述hemA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 

所述hemD的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。 

所述hemF的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。 

所述大肠杆菌优选DH5α、JM109、W3110或BL21(DE3)。 

所述大肠杆菌进一步优选BL21(DE3)。 

所述hemL与hemA优选以pACYCDuet-1表达载体进行共表达，得到表达载体pACYCDuet-1-hemLA。 

表达hemD或hemF时，优选将hemD或hemF基因分别通过酶切位点NdeI、XhoI连接pCDFDuet-1，得到重组表达载体pCDFDuet-1-hemD或pCDFDuet-1-hemF。 

表达hemD和hemF时，可以共用一个表达载体。优选将hemD与pCDFDuet-1-hemF连接。进一步优选通过酶切位点BamHI和PstI与pCDFDuet-1-hemF连接，得到重组表达载体pCDFDuet-1-hemD-hemF。 

本发明还提供一种构建所述大肠杆菌工程菌株的方法，利用pACYCDuet-1表达hemL和hemA，以pCDFDuet-1表达来源于大肠杆菌的尿卟啉原III合酶(hemD编码)和/或粪卟啉原III氧化酶(hemF编码)，获得高产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌株。 

具体包括以下步骤：