[发明专利]一种耐高温重组β-甘露聚糖酶及其应用

权利要求书

1.一种耐高温重组β-甘露聚糖酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。 

2.一种耐高温重组β-甘露聚糖酶的编码基因，其特征在于，是满足下列要求的核苷酸序列之一： 

(1)编码如SEQ ID No：2所示氨基酸序列的核苷酸序列； 

(2)如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。 

3.一种表达耐高温重组β-甘露聚糖酶的重组菌株，其特征在于，该菌株为基因组上整合了权利要求2所述的β-甘露聚糖酶的编码基因的毕赤酵母。 

4.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，所述的毕赤酵母为分泌型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。 

5.构建权利要求3所述的重组菌株的方法，其特征在于，它包括如下步骤： 

(1)应用常规重组质粒构建方法构建出重组密码子优化质粒pPICZαA–man，该质粒以AOX1为启动子，并含有SEQ ID No：1所示的β-甘露聚糖酶基因和Zeocin抗性基因； 

(2)将重组密码子优化质粒pPICZαA–man用Sac I酶切线性化后，电击转化入毕赤酵母宿主菌中，即构成表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母重组菌株； 

(3)将重组菌株经过甲醇利用表型筛选、外源基因多拷贝整合筛选以及诱导表达筛选后，即筛选出过量表达β-甘露聚糖酶的重组工程菌。 

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的重组质粒pPICZαA–man是密码子偏好性优化后合成的目的基因man插入到质粒pPICZαA中形成的重组质粒。 

7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，在将重组密码子优化质粒pPICZαA–man用Sac I酶切线性化之后，电击转化入毕赤酵母宿主菌中之前，可将密码子优化质粒pPICZαA–man导入大肠杆菌进行扩增。 

8.权利要求1所述的耐高温重组β-甘露聚糖酶的制备方法，其特征在于，将权利要求3所述的重组菌在BMGY培养基中30℃培养至细胞密度OD_600nm＝2～6，室温离心收集菌体，用BMMY液体培养基将细胞重悬至OD_600nm为1.0以诱导表达，28℃继续培养72h，每24h向培养基添加纯甲醇至终浓度为1v/v％，将完成培养的重组菌经离心除去菌体，收集上清液，经超滤和分子筛纯化制备得到耐高温重组β-甘露聚糖酶。 

9.权利要求1所述的耐高温重组β-甘露聚糖酶在酶法制备甘露低聚糖中的应用。 

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，以富含甘露聚糖的生物质为原料酶法制备甘露低聚糖，所述的生物质为魔芋粉、田菁胶、刺槐豆胶和瓜尔胶的一种或多种。 

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，以10-50IU/g的耐高温重组β-甘露聚糖酶添加量、于pH4.0-6.0、50-90℃的震荡或搅拌条件下酶解底物浓度为30-200g/L生物质溶液，酶解0.5-8h后降温离心去残渣，上清即为甘露低聚糖。 

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，底物浓度为100-200g/L的高浓度生物质，酶用量为10-50IU/g，酶初始阶段一次性加入，底物分多次添加，添加时间间隔在1-3h，pH4.0-6.0、50-90℃的震荡或搅拌条件下共酶解4-12h后冷却后离心去残渣，上清即为甘露低聚糖。