[发明专利]一种耐高温重组β-甘露聚糖酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种耐高温重组β-甘露聚糖酶及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

甘露低聚糖是由甘露糖与葡萄糖以β-1,4糖苷键连接形成的聚合度为2～10的功能性寡糖。甘露低聚糖具有促进人和动物肠道内以双歧杆菌为代表的有益菌的增殖、改善肠道内菌群结构等功能性低聚糖共同的理化特性，同时也有清除自由基、增强机体抗氧化性的能力，若将甘露低聚糖作为功能性食品添加剂应用于工业开发，应用前景十分广阔。

魔芋是我国云南、四川、陕西、贵州等地盛产的多年生草本植物，其芋块茎中含有丰富的甘露聚糖。目前，魔芋粉主要被作为食用粗纤维或作为食品添加剂，开发利用程度不够。利用β-甘露聚糖酶将魔芋水解制成甘露低聚糖，可大大拓宽魔芋粉的应用范围，提高原料附加值，具有广泛的经济效益和社会效益。酶法制备甘露低聚糖的核心技术是采用高活力β-甘露聚糖酶和高浓度魔芋胶溶液。但目前发酵酶活力低，导致酶的生产和使用成本高；同时由于魔芋胶水溶液的粘度非常大，40g/L的魔芋胶已呈凝胶状态，可阻止酶对它的水解作用。因此国内外文献报道的魔芋胶酶水解工艺均采用10～30g/L的魔芋胶溶液，导致了酶解产物的后处理成本高、生产效率低。因此解决酶法制备甘露低聚糖所遇到的问题，首先要得到活力高稳定性好的β-甘露聚糖酶，其次是优化酶解工艺提高底物浓度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种耐高温重组β-甘露聚糖酶。

本发明还要解决的技术问题是提供上述β-甘露聚糖酶酶解高浓度魔芋粉制备甘露低聚糖的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种耐高温重组β-甘露聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

一种耐高温重组β-甘露聚糖酶的编码基因，是满足下列要求的核苷酸序列之一：

(1)编码如SEQ ID No：2所示氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。

一种表达耐高温重组β-甘露聚糖酶的重组菌株，该菌株为基因组上整合了权利要求2所述的β-甘露聚糖酶的编码基因的毕赤酵母。

其中，所述的毕赤酵母为分泌型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。

构建上述重组菌株的方法，它包括如下步骤：

(1)应用常规重组质粒构建方法构建出重组密码子优化质粒pPICZαA–man，该质粒以AOX1为启动子，并含有SEQ ID No：1所示的β-甘露聚糖酶基因和Zeocin抗性基因；

(2)将重组密码子优化质粒pPICZαA–man用Sac I酶切线性化后，电击转化入毕赤酵母宿主菌中，即构成表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母重组菌株；

(3)将重组菌株经过甲醇利用表型筛选、外源基因多拷贝整合筛选以及诱导表达筛选后，即筛选出过量表达β-甘露聚糖酶的重组工程菌。

步骤(1)中，所述的重组质粒pPICZαA–man是密码子偏好性优化后合成的目的基因man插入到质粒pPICZαA中形成的重组质粒。具体方法参见Invitrogen公司的Multi-Copy Pichia Expression Kit操作手册。

步骤(2)中，在将重组密码子优化质粒pPICZαA–man用Sac I酶切线性化之后，电击转化入毕赤酵母宿主菌中之前，可将密码子优化质粒pPICZαA–man导入大肠杆菌进行扩增。

上述耐高温重组β-甘露聚糖酶的制备方法，将上述重组菌在BMGY培养基中30℃培养至细胞密度OD_600nm＝2～6，室温离心收集菌体，用BMMY液体培养基将细胞重悬至OD_600nm为1.0以诱导表达，28℃继续培养72h，每24h向培养基添加纯甲醇至终浓度为1v/v％，将完成培养的重组菌经离心除去菌体，收集上清液，以分子量为10KDa的超滤管，滤去小分量的蛋白和盐，经过分子筛Superdex75PrepGrade纯化，使用100mmol/L pH5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，流速0.3ml/min洗脱，分布收集洗脱峰中的样品，经过酶活测定，确定目的样品所在的收集管，得到电泳纯的目的蛋白，该重组β-甘露聚糖酶酶活为1168IU/mg，最适反应温度为80℃，最适pH为5.0。

上述耐高温重组β-甘露聚糖酶在酶法制备甘露低聚糖中的应用。