[发明专利]HRM分析技术检测硫嘌呤个体化用药基因多态性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及硫嘌呤类药物个体化用药相关基因多态性的检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

硫嘌呤类药物，如6-巯基嘌呤（6-mereaptopuring，6-MP）及其前体药物硫唑嘌（azathiopurine，AZA）等，常用于治疗血液系统恶性肿瘤、自身免疫性疾病以及器官移植术后的排斥反应。此类药物本身无生物活性，在体内经过一系列代谢反应生成具有药理活性的6-巯基嘌呤核苷酸（6-thioguanine nucleotides，6-TGN），能够干扰核苷酸代谢，具有抗增殖和免疫抑制作用，也是引起骨髓抑制等毒副作用的主要原因。

硫嘌呤甲基转移酶(TPMT)在硫嘌呤类药物的体内代谢中起着重要作用，其活性直接影响药物的疗效和毒副作用的产生。临床上给予标准剂量的嘌呤类药物治疗时，对于TPMT活性高的病人，则可能因为硫嘌呤类药物用量不足，出现在维持治疗期间复发；而对于TPMT活性低下或者缺失的病人，则会导致骨髓抑制等毒副作用。因此美国FDA推荐，在接受硫嘌呤类药物治疗前，患者应该接受TPMT基因分型检测，非野生型患者应尽量避免硫嘌呤类药物的使用，从而预防严重毒副作用的发生。

TPMT基因定位于6p22.3，全长34kb，包含10个外显子和9个内含子。迄今已发现30多种突变型等位基因（ TPMT*2-TPMT*34）与TPMT酶活性降低相关。野生型纯合子（TPMT*1）决定酶的高活性，杂合子表现为中度活性，突变型纯合子的酶活性极低甚至缺失。其中TPMT*2（G238C）、TPMT*3A（G460A、A719G）、TPMT*3B（G460A）和TPMT*3C（A719G）四种基因型约占中度和低酶活性表型的80%~95%。TPMT*3A基因型个体TPMT活性完全丧失，TPMT*3B和TPMT*3C个体TPMT催化活性分别降低9和1.4倍，研究表明TPMT中等活性和低活性个体只能接受10~50%的平均巯嘌呤化疗剂量。

TPMT*3C (A719G)为中国人群中主要的等位基因突变类型，可导致TPMT酶活性降低，从而增加硫嘌呤类药物产生毒副作用的可能性。因此，对TPMT的基因检测有助于临床合理确定硫嘌呤类药物的用量和正确评估该药在特定个体可能产生的毒副作用。

本发明应用一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法——高分辨熔解曲线（High resolution melting，HRM）分析技术。通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR产物的结合情况，SNP位点碱基不同会使双链DNA的TM值发生变化从而双链DNA在升温过程中先后解开，形成不同的熔解曲线形状，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、杂合子与纯合子等都会影响熔解曲线的峰形，能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，采用新型饱和染料更易于检测单碱基突变、小片段插入或缺失。该方法与其他遗传分型技术相比，操作简单，具有灵敏度高、特异性好、成本低、快速、高通量检测等优点，结果准确，且实现了真正的闭管操作。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单易行的硫嘌呤类药物个体化用药相关基因多态性的检测方法。

为了达到上述目的，本发明提供一种利用HRM分析技术检测硫嘌呤类药物个体化用药相关基因（硫嘌呤甲基转移酶）多态性的方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步： 采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，采用电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到10ng/ul。 

第二步：采用在线软件Primer 3设计HRM引物，确定最佳引物为18-25bp大小，PCR产物长度80-150bp。相关引物信息如下：

TPMT  rs1142345引物序列：

rs1142345-F  GGTTGATGCTTTTGAAGAACG

rs1142345-R  CCTCAAAAACATGTCAGTGTGA