[发明专利]一种农杆菌介导的麻疯树遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于植物遗传工程技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的麻疯树遗传转化方法，更具体涉及一种应用于麻疯树子叶外植体转化受体系统的农杆菌介导的遗传转化方法。 

背景技术

植物遗传转化是一种重要和先进的育种技术。麻疯树由于其种子中含油量较高（40～60%），可以开发为“生物柴油”，因而成为一种非常具有应用前景的能源植物，但其分布区域较窄，种子结实率较低，种子油的质量也还有待于进一步改良。为了扩大麻疯树的种植区域，培育出了高产、优质的麻疯树新品种，可以利用遗传转化技术达到这些目的。目前，植物遗传转化的技术已经基本成熟，而最为通常的转化方法是应用农杆菌介导法将外源基因导入到受体植物的细胞并整合到染色体基因组中以实现外源基因稳定的遗传和表达。 

在采用常规的农杆菌转化麻疯树子叶外植体的过程中，由于子叶外植体再生不定芽方法还不够先进，同时侵染外植体的农杆菌菌液浓度较高，侵染时间较长，需要采用抗生素溶液清洗外植体，导致获得外植体再生不定芽质量较差，再生不定芽的效率较低，需要对再生不定芽进行额外的增殖培养和伸长培养，因而还导致获得再生不定芽芽条的培养时间较长（一般需要3-4个月）；进行生根培养时，对芽条的质量要求比较高，一般要求长度大于2.5 cm的芽条；生根培养基中抗生素的添加严重抑制了麻疯树抗性芽条的生根，导致麻疯树外植体在遗传转化处理后很难得到能够栽培成活的完整植株，即使获得了完整的转化植株，所需的培养周期也较长（一般需要5个月）。目前报道的转基因植株的检测一般是获得完整抗性植株后提取DNA，然后进行报告基因的PCR扩增和Southern杂交检测，这样就造成那些未能进入生根培养或者生根未能成功的阳性芽被淘汰，导致最终的转化效率偏低。 

发明内容

本发明目的是针对现有农杆菌介导的麻疯树子叶外植体遗传转化方法存在转化率低、时间长的缺陷，提供一种应用于麻疯树子叶外植体转化受体系统的农杆菌介导的遗传转化方法。 

    本发明通过以下技术方案实现上述发明目的： 

一种农杆菌介导的麻疯树遗传转化方法，包括如下步骤：

S1.获取麻疯树子叶外植体，将子叶外植体在20 mg/L高浓度TDZ溶液中浸泡40分钟后取出；

S2.将子叶外植体置于无激素的预培养基上培养1～4天后，用OD₆₀₀为0.1～0.2的低浓度农杆菌菌液侵染子叶外植体30秒；

S3.将侵染后的子叶外植体置于无抗生素和激素的共培养基上培养1～6天后，再将子叶外植体置于无激素的筛选和恢复培养基上培养，获得抗性芽；

S4.将抗性芽进行伸长培养，对伸长后的小芽或芽条进行PCR检测，以PCR检测结果为阳性的小芽或芽条为接穗进行微嫁接，获得遗传转化苗。

    本发明为了提高麻疯树子叶外植体再生不定芽的质量和效率，对子叶外植体采用高浓度的TDZ溶液进行预处理；对外植体进行侵染时，采用低浓度的农杆菌菌液（OD<0.2）浸泡侵染30秒左右，可以大大提高遗传转化效率；长度大于0.5 cm抗性芽经过叶片直接PCR检测后，以转化小芽或芽条为接穗，嫁接到作为砧木的无菌萌发的麻疯树幼苗的下胚轴上，可以在较短的时间内获得完整的转化植株（只需2个月），而不需要对抗性芽进行额外的伸长和生根培养，并且把传统方法中由于质量不佳、长度较短（0.5～2.5 cm）而被忽视的小芽（未利用这些小芽进行生根诱导培养但它们也可能是转化芽）也都充分利用起来。应用本研究的方法，可以提高麻疯树子叶外植体遗传转化效率，显著缩短获得转化植株的时间。 

优选地，S2所述预培养基的培养时间为1天。 

优选地，S3所述共培养基的培养时间为2天。 

优选地，S2所述农杆菌菌液为含有pCambia 1300重组质粒的EHA105农杆菌菌液。 

优选地，S2所述预培养基为：MS培养基配方的无机成分+MS培养基配方的有机成分+100 mg/L肌醇+30 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L琼脂，pH为5.8～6.0。 

优选地，S3所述共培养基为：MS培养基配方的无机成分+MS培养基配方的有机成分+2 g/L肌醇+500 mg/L水解酪蛋白+30 g/L蔗糖+100 mg/L乙酰丁香酮，pH为5.5。