[发明专利]鼠多瘤病毒衣壳粒的新型亲和肽配基及其设计筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用计算机模拟设计目标蛋白质的亲和肽配基技术，以及利用亲和色谱技术纯化目标蛋白质，属于生物技术中的计算机模拟和蛋白质分离纯化技术领域。

背景技术

鼠多瘤病毒样颗粒(Virus-Like Particles,VLP)是由主要衣壳结构蛋白VP1(42kDa)自组装而形成的空心纳米颗粒，在疫苗、基因治疗、药物载体和材料科学等领域具有广阔的应用前景。鼠多瘤病毒VLP包含72个向右歪斜的呈T＝7d排布的衣壳粒，每个衣壳粒由5个VP1组成。

VP1在原核细胞中表达纯化后以衣壳粒形态存在，在体外适宜条件下能组装成形态均一、结构稳定的VLP。这种体外生产VLP的方法简单、高效，具有广阔的应用前景。目前，利用高细胞密度、pH控制流加培养可制备N端带有GST标签的VP1，其产量能够达到4.38g L^-1。其中，GST标签既能够促进VP1蛋白的可溶性表达，又利于带标签前体的纯化。然而在纯化后处理时，需要昂贵的凝血酶切割使GST标签脱落，且脱落的GST标签还需要额外的分离纯化步骤从反应体系中去除。因而导致操作繁琐、成本增大，不利于生产扩大，限制鼠多瘤病毒样颗粒的应用。

亲和色谱利用生物大分子和特异性配基间的相互作用分离纯化目标分子，具有高选择性、高效率、操作条件温和等优点。亲和色谱的实现取决于目标分子与配基之间的特异性识别，因此配基是亲和色谱的核心。其中，小分子肽配基具有高亲和性高、高稳定性、不易降解及制备简便等优点，具有重要的开发前景。而近年来随着分子模拟技术的飞速发展，通过模拟自然界已存在的目标蛋白-配体之间的相互作用以设计筛选高特异性亲和肽配基成为可能，有助于提高亲和肽配基的筛选效率及准确性。

鼠多瘤病毒衣壳粒和次要衣壳结构蛋白VP2(35kDa)复合物是天然存在的衣壳粒-配体结合物，其中，VP2的C端(VP2-C)通过疏水作用以一种特殊的发卡结构形态结合到衣壳粒的内表面，可作为衣壳粒的亲和肽配基的设计基础。

发明内容

本发明的目的在于提出鼠多瘤病毒衣壳粒新型亲和配基设计及筛选方法的应用。本发明所述的衣壳粒亲和肽配基的仿生设计流程是首次建立的，并经验证是有效的。所述的亲和肽配基具有特异性强、稳定性好和操作简便等优点。

本发明的技术方案如下：

鼠多瘤病毒衣壳粒的新型亲和肽配基：DWDLRLLY、DWDLRLIY、DWNLRLIY、DWFLNLFY、DWSLKLVY、DWSLRLKY和DWNLHLPY。

本发明的鼠多瘤病毒衣壳粒的新型亲和肽配基及其设计筛选方法，是依据天然存在的衣壳粒和次要衣壳结构蛋白VP2-C复合物晶体结构，构建衣壳粒的新型肽配基库，特征序列为DWXLXLXY，其中X代表除去半胱氨酸以外的19种氨基酸；见核苷酸序列表。

利用分子动力学模拟/泊松-波尔兹曼溶剂可及表面积计算解析VP2-C与衣壳粒复合物的分子作用机理，确定疏水作用占主导，而VP2-C中对结合起重要贡献的关键残基为V283、P285、D286、W287、L289、L293和Y296。

多肽库构建依据为VP2-C中5个关键残基：D286、W287、L289、L293和Y296；在肽库的范围内，利用氨基酸定位法构建候选多肽分子库。

通过分子对接筛选、均方根偏差比较以及分子动力学模拟结合自由能计算，进行鼠多瘤病毒衣壳粒的高亲和性肽配基的筛选。

利用VINA分子对接软件将肽配基库中的肽配基依次与鼠多瘤病毒衣壳粒进行对接，选取结合自由能低于-6.5kcal/mol的肽配基，共计1158条。

利用GROMACS分子模拟软件自带的g_rms程序计算VINA对接得到的1158个肽配基与VP2-C中相应的关键残基之间的均方根偏差，选择334个肽配基进行研究。

根据C末端方向对334个肽配基继续筛选，选取C末端方向与VP2-C一致的227个肽配基进行ROSETTA FlexPepDock对接实验复筛，选取最优的10条肽配基进行MD模拟。