[发明专利]一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法，属于酶工程领域。

背景技术

角蛋白酶(Keratinase)为一种可以特异性降解角蛋白的酶类，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物产生。角蛋白酶在食品、医药、饲料、精化和制革等工业中广泛应用，具有嫩化肉类、生产高级营养品、免疫制剂和饲料添加剂以及美容、软化皮革等作用，并可导致疯牛病和人类克雅氏症的阮蛋白(Prion)的降解。虽然角蛋白酶有着巨大的应用和研究价值，但是从野生菌中筛选出的角蛋白酶热稳定性差，底物专一性不高，大大降低了角蛋白酶的开发和运用。目前已经报道的角蛋白酶基因主要来自国外的一株地衣芽胞杆菌的kerA基因。本专利介绍一种由本实验室自主筛选获得的具有高效降解羽毛能力的嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1，并将角蛋白酶KerSMD进行分子改造，提高其热稳定性和底物专一性，为角蛋白酶的规模化生产及推广具有深远的技术指导意义。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种角蛋白酶突变体，热稳定性和酶活得到提高，是将嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1中角蛋白酶KerSMD的C端前导肽和/或N端前导肽替换为嗜麦芽窄食单胞菌BBE11-1中角蛋白酶KerSMF中的相应的前导肽序列。

所述角蛋白酶KerSMD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，角蛋白酶KerSMF的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述角蛋白酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.3所示突变体(P2C2T1)是从氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角蛋白酶KerSMD出发，将其C端前导肽结构域(Cys486-Gln590)的105个氨基酸替换成氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶KerSMF的C端前导肽结构域(Pro445-Tyr548)的104个氨基酸，获得新的角蛋白酶突变体P2C2T1。

SEQ ID NO.4所示突变体(P1C2T2)是从氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角蛋白酶KerSMD出发，将其N端前导肽123个氨基酸(Ala1-Ala123)替换成氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶KerSMF的N端前104个氨基酸(Gly1-Thr104)，获得新的角蛋白酶突变体P1C2T2。

SEQ ID NO.5所示突变体(P1C2T1)，是从氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角蛋白酶KerSMD出发，将其N端前导肽123个氨基酸替换成氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶KerSMF的N端前104个氨基酸，并且将其C端前导肽结构域(Cys486-Gln590)的105个氨基酸替换成角蛋白酶KerSMF的C端前导肽结构域(Pro445-Tyr548)的104个氨基酸，获得新的角蛋白酶突变体P1C2T1。

本发明要解决的第二个技术问题是提供获得所述角蛋白酶突变体的方法，具体步骤如下：

(1)根据从嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1中获得编码角蛋白酶KerSMD、KerSMF的基因，克隆到pET22b(+)中，构建重组质粒pET22b+kerSMD和pET22b+kerSMF；

(2)采用融合PCR的方法，设计含首尾重叠片段的引物，PCR扩增得到编码三种角蛋白酶突变体的基因序列，连接表达载体pET22b(+)获得含有突变体序列的重组载体；

(3)将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达，发酵上清液即角蛋白酶突变体粗酶液。

所述方法还进一步包括使用AKTA蛋白纯化仪和HisTrap FF crude1ml的镍柱对角蛋白酶进行纯化。

将所述方法中步骤(3)获得的优质基因工程菌在含有100μg/l的氨苄青霉素的LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入含有100μg/l的氨苄青霉素的LB发酵液体培养基37℃培养至OD₆₀₀＝0.6，降温至20℃培养，加入最终浓度0.1mM的诱导剂IPTG诱导，72h时离心获得上清酶液，即为粗酶液。