[发明专利]针对食品中的沙门氏菌和志贺氏菌的多重PCR检测用引物组、试剂盒及检测方法

说明书

本发明适用于食品微生物安全检测领域，提供了一种针对食品中的沙门氏菌和志贺氏菌的多重PCR检测用引物组、试剂盒及检测方法。本发明的多重PCR检测用引物组、试剂盒及检测方法通过组合利用沙门氏菌和志贺氏菌的种属特异性鉴别基因，可实现检测覆盖范围广、特异性强且灵敏度高的技术效果，并且检测耗时短、操作较简单、设备要求低、通量高，可以节省大量的人力、物力和财力，适合快速检测的要求，易于在实际生产中推广应用。

技术领域

本发明属于食品微生物安全检测领域，涉及利用多重PCR技术对食品中的致病菌进行快速检测鉴定的引物组、试剂盒及方法。具体而言，本发明涉及针对食品中的沙门氏菌(Salmonella sp.)和志贺氏菌(Shigella sp.)的多重PCR检测用引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

近几年，食品安全事件频频出现，食品安全问题也越来越被社会公众所关注和重视。许多食源性致病菌通过水和食物传播而引发食源性疾病，其发病率和死亡率都呈现逐渐增加的趋势。在世界范围内，每年有超过30％的人口感染食源性疾病，造成数十亿美元的花销。预防和控制食源性疾病的发生和传播，已成为解决社会食品安全问题的重要举措之一。能否及时有效地控制与预防食源性疾病的发生和传播，关键在于能否快速准确地检测与鉴定食源性致病菌。

沙门氏菌和志贺氏菌是引起食源性疾病主要的两类致病菌，国内外由这两类致病菌引发的食物中毒事件频频发生。这两类致病菌在食品中分布比较普遍，其污染食品后，不仅导致食品腐败变质，还能产生多种毒素，造成严重的疾病，如沙门氏菌会引起局部化脓感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎、败血症、脓毒症等；志贺氏菌会引起肠炎、肠溃疡、肠功能紊乱、中毒性休克等。

目前世界各国都把沙门氏菌和志贺氏菌列为食品卫生的法定检测项目。在检测手段上，目前国内外检测机构仍主要采用FDA、AOAC、ISO和GB等标准对沙门氏菌和志贺氏菌进行检测，整个过程一般需要3-5天，上述检测手段操作复杂，检测通量不高，很难满足对食源性致病菌进行快速准确检测的现实需求。因此，建立新的对沙门氏菌和志贺氏菌进行快速检测的方法就显得尤为迫切。

近年来，借助于免疫学和分子生物学等方法，对沙门氏菌和志贺氏菌的快速检测有了很大发展，目前国内外针对沙门氏菌和志贺氏菌进行快速检测的方法很多，如：PCR-凝胶电泳法、实时荧光PCR法、基因芯片测试法、全自动细菌生化检定仪、酶联免疫吸附法、荧光免疫检测法(VIDAS)、胶体金免疫测试条等。但是，免疫学方法如酶联免疫吸附法、免疫荧光法和乳胶凝集试验等在操作程序、检测时间和特异性等方面尚不理想，并且检测成本极高；而在分子生物学方法方面，如PCR技术则以灵敏、特异、简便、快速、成本低等优点被越来越多地应用。

以单目标基因为检测对象的常规单重PCR技术假阳性高、通量低、无法实现对多个目标基因及多种目的菌的同时检测，相比之下，多重PCR技术能在同一PCR反应体系内实现对多个目标基因的同步扩增，从而能够快速、灵敏、特异地检测食源性致病菌。具体而言，多重PCR检测法采用将多个目标基因联用的方式，只要检测出多个目标基因中的任意一种，即可做出初步判断；进而，通过不同目标基因间检测结果的互相映证，便可实现提高检测准确度、降低假阳性率的效果。

目前，应用多重PCR对食品中的常见致病菌进行检测已有较多报道，但由于多种因素，例如所选取的引物和模板的种类和浓度、Mg²⁺和dNTP的浓度等均可能对多重PCR的结果产生影响，因此，同时检测的目标微生物种类越多，建立PCR体系的难度越大，检测的特异性及灵敏度越难得到保证。