[发明专利]MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法及其应用

权利要求书

1.MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）微载体处理：

将Cytodex系列微载体用pH为7.4的PBS缓冲液浸泡3-24h，并清洗两次，高压灭菌，冷却静置，以含有牛血清的细胞培养液清洗后加入相同体积的含牛血清的细胞培养液备用；

将GF系列微载体用含有吐温-80的纯化水浸泡3-24h，再用pH为7.4的PBS缓冲液清洗后，高压灭菌，冷却静置，以含有牛血清的细胞培养液清洗后加入相同体积的含牛血清的细胞培养液备用；

2）MDCK种子细胞复苏：

从液氮中取出冻存的MDCK细胞，在37℃-39℃的水浴中快速解冻复苏细胞，复苏后用含有牛血清的细胞培养液在方瓶中静置培养至细胞生长到方瓶生长面90%以上致密；

3）种子细胞的扩大培养：

待步骤2）中的细胞生长到方瓶生长面90%以上致密时，用细胞消化液消化细胞，按照（1：2）-（1：10）的分瓶比例扩大培养至转瓶培养所需的细胞数；再接种到转瓶培养，待细胞生长到转瓶生长面90%以上致密时，用细胞消化液消化细胞，按照（1：2）-（1：10）的分瓶比例扩大培养至生物反应器培养所需的细胞数；

4）生物反应器微载体培养：

按照每升培养体积内投放2-25g微载体、每个微载体上接种5-50个细胞的比例将转瓶培养的MDCK细胞消化后接种到生物反应器中培养至90%微载体表面形成致密单层。

2.根据权利要求1所述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，其特征在于，所述步骤1）的Cytodex系列微载体处理过程中，每克微载体浸泡用PBS缓冲液的用量为大于20mL；每克微载体每次清洗用的PBS缓冲液用量为大于20mL，每克微载体每次清洗用的含有牛血清的细胞液用量为大于20mL；所述含有牛血清的细胞培养液为含体积百分含量2%-10%牛血清的DMEM高糖培养液；所述牛血清为新生小牛血清或胎牛血清。

3.根据权利要求1所述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，其特征在于，所述步骤1）的GF系列微载体处理过程中，所述含有吐温-80的纯化水为含有体积百分含量为0.01%吐温-80的纯化水；每克微载体浸泡用含有吐温-80的纯化水的用量为大于20mL；每克微载体每次清洗用的PBS缓冲液用量为大于20mL，每克微载体每次清洗用的含有牛血清的细胞液用量为大于20mL；所述含有牛血清的细胞培养液为含体积百分含量2%-10%牛血清的DMEM高糖培养液；所述牛血清为新生小牛血清或胎牛血清。

4.根据权利要求1所述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，其特征在于，所述步骤2）中，所述含有牛血清的细胞培养液为含有体积百分含量8%-10%牛血清的DMEM高糖培养液；所述培养温度为37℃。

5.根据权利要求1所述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，其特征在于，所述步骤3）中，细胞消化液为质量百分比浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液；细胞培养液为含有体积百分含量8%-10%牛血清的DMEM高糖培养液；转瓶培养的转速为2-15rpm/min；培养温度为37℃。

6.根据权利要求1所述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，其特征在于，所述步骤4）中，微载体为步骤1）中处理过的Cytodex系列微载体或GF系列微载体；细胞消化液为质量百分比浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液；细胞培养液为含有体积百分含量8%-10%牛血清的DMEM高糖培养液；反应器的培养条件为：转速20-50rpm，温度37℃，pH值7.2-7.4，溶氧20-80%。

7.根据权利要求1-6任一所述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法培养的MDCK细胞在制备人用流感疫苗中的应用。

8.根据权利要求1-6任一所述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法培养的MDCK细胞在制备禽流感疫苗中的应用。