[发明专利]MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法及其应用

说明书

 

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法及其应用。

背景技术

流感(Influenza) ，是由甲(A) 、乙(B) 、丙(C) 三型流感病毒分别引起的急性呼吸道传染病，常造成不同程度的流行，包括世界大流行、局部暴发流行及散发。禽流感（Bird Flu或Avian Influenza）是禽流行性感冒的简称，它是由甲型流感病毒的一种亚型（也称禽流感病毒）引起的一种急性传染病，也能感染人类，通常人感染禽流感死亡率约为33%。目前为止无论是流感还是禽流感未找到理想的治疗药物，疫苗接种仍是当今防止疾病发生和流行最有效的手段。

我国流感疫苗和禽流感疫苗生产主要采用鸡胚生产工艺，鸡胚生产工艺存在生产周期长、操作繁琐、工作量大、易污染等诸多缺陷，如遇禽流感大规模爆发，鸡胚的供应也将存在很大问题。若采用传代细胞生产疫苗的工艺将不受鸡胚等天然因素的限制，且生产周期短，工艺简单，如遇流感暴发会快速反应，短时间内可提供大量疫苗产品。另外，贴壁型的传代细胞可用生物反应器微载体规模化培养，生产中可将细胞生长和病毒繁殖自动控制在最适条件范围内，提高细胞密度和病毒滴度，实现大批次量、小批间差，产品具有更好的稳定性和安全性，大量节省劳动力、生产场地和能源消耗，降低生产成本，与鸡胚直接增殖病毒的工艺和转瓶培养传代细胞增殖病毒的工艺相比具有明显优势。

MDCK细胞（Madin-Daby Canine Kidney Cells, MDCK）由Madin和Darby于1958年从美国Cocker Spaniel母曲架犬肾脏组织分离培育建立，由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易变异，MDCK细胞系被公认为是最适于流感病毒复制的3种细胞系之一。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种利用生物反应器微载体培养MDCK细胞的培养方法。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，包括以下步骤：

1）微载体处理：

将Cytodex系列微载体用pH为7.4的PBS缓冲液浸泡3-24h，并清洗两次，高压灭菌，冷却静置，以含有牛血清的细胞培养液清洗后加入相同体积的含牛血清的细胞培养液备用；

将GF系列微载体用含有吐温-80的纯化水浸泡3-24h，再用pH为7.4的PBS缓冲液清洗后，高压灭菌，冷却静置，以含有牛血清的细胞培养液清洗后加入相同体积的含牛血清的细胞培养液备用；

2）MDCK种子细胞复苏：

从液氮中取出冻存的MDCK细胞，在37℃-39℃的水浴中快速解冻复苏细胞，复苏后用含有牛血清的细胞培养液在方瓶中静置培养至细胞生长到方瓶生长面90%以上致密；

3）种子细胞的扩大培养：

待步骤2）中的细胞生长到方瓶生长面90%以上致密时，用细胞消化液消化细胞，按照（1：2）-（1：10）的分瓶比例扩大培养至转瓶培养所需的细胞数；再接种到转瓶培养，待细胞生长到转瓶生长面90%以上致密时，用细胞消化液消化细胞，按照（1：2）-（1：10）的分瓶比例扩大培养至生物反应器培养所需的细胞数；

4）生物反应器微载体培养：

按照每升培养体积内投放2-25g微载体、每个微载体上接种5-50个细胞的比例将转瓶培养的MDCK细胞消化后接种到生物反应器中培养至90%微载体表面形成致密单层。

进一步的，上述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，所述步骤1）的Cytodex系列微载体处理过程中，每克微载体浸泡用PBS缓冲液的用量为大于20mL；每克微载体每次清洗用的PBS缓冲液用量为大于20mL，每克微载体每次清洗用的含有牛血清的细胞液用量为大于20mL；所述含有牛血清的细胞培养液为含体积百分含量2%-10%牛血清的DMEM高糖培养液；所述牛血清为新生小牛血清或胎牛血清。

进一步的，上述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，所述步骤1）的GF系列微载体处理过程中，所述含有吐温-80的纯化水为含有体积百分含量为0.01%吐温-80的纯化水；每克微载体浸泡用含有吐温-80的纯化水的用量为大于20mL；每克微载体每次清洗用的PBS缓冲液用量为大于20mL，每克微载体每次清洗用的含有牛血清的细胞液用量为大于20mL；所述含有牛血清的细胞培养液为含体积百分含量2%-10%牛血清的DMEM高糖培养液；所述牛血清为新生小牛血清或胎牛血清。