[发明专利]一株提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一株提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株的构建方法及其应用。以及该工程菌株在以木薯为原料浓醪发酵生产燃料乙醇中的应用。

背景技术

燃料乙醇目前被认为是最有可能大规模替代石油的液体燃料，市场潜力十分巨大，非粮乙醇的规模化商业开发将成为我国最有前途的新兴能源产业之一。目前我国生产乙醇的主要原料是以玉米等粮食作物为主，但是我国人口众多，存在“与民争粮”的问题。在纤维素转化为乙醇的技术成熟之前，未来燃料乙醇发展更多的应是依靠非粮原料。木薯具有产量高、耐贫瘠、耐干旱、耐酸性、抗逆性强等特性，其块根淀粉含量可达70％以上，有“淀粉之王”的美称，是生产燃料乙醇的首选低成本原料。广西的木薯种植面积和产量居全国首位，广西利用高产木薯作为原料生产燃料乙醇是世界首创。我国《可再生能源发展“十二五”规划》在政策上明确支持建设具备条件的木薯乙醇等非粮项目，因此木薯燃料乙醇具有长期的可行性。

浓醪发酵是燃料乙醇发酵工业发展的有效途径之一，其有以下优点：(1)提高单位体积和时间内发酵浓度，增加了发酵强度，提高乙醇产量和设备利用率。(2)醪液酒度的提高，能有效降低乙醇蒸馏蒸气的用量，从而降低了煤电的消耗。如将乙醇发酵的浓度由12％(v/v)提高至16％(v/v)，可节省蒸馏能耗25％左右。(3)节约工艺用水，并可减少乙醇蒸馏损失。(4)实现浓醪发酵可以减少企业污水处理负担。然而，与传统发酵相比，酿酒酵母在浓醪发酵过程中，面临着严峻的环境胁迫，在浓醪发酵过程中，酵母菌随着发酵液乙醇、乙醛等毒性物质浓度的升高，发酵速率逐渐下降，导致发酵周期延长，并使发酵终点乙醇浓度降低，残糖升高，可见发酵终点的乙醇浓度与酵母菌本身的耐乙醇性能有关。

近年来，国内已开始采用耐乙醇酵母进行工业化浓醪发酵生产乙醇，玉米原料乙醇发酵浓度可达13％(v/v)，木薯原料乙醇发酵浓度低于玉米且发酵效率不高。在高浓度乙醇发酵技术研究上，国内有关的科研机构已开展了相应的工作，其发酵菌株乙醇发酵浓度最高可达15％-16％(v/v)，但其发酵时间较长，发酵效率低于92％，同时其发酵底物大多为玉米和精制淀粉。乙醇浓醪发酵会引起糖浓度和乙醇浓度升高，导致酵母菌的生长受到抑制和乙醇发酵不彻底的现象，是制约木薯原料浓醪发酵的主要的关键因素之一。因此，提高工业乙醇酵母的逆境耐受性，是选育发酵生产燃料乙醇菌种的重要指标。利用代谢工程构建选育具有高抗逆性的工业酿酒酵母菌株是突破浓醪发酵瓶颈的关键所在，对于燃料乙醇的发酵生产，尤其是高浓度乙醇发酵具有重要意义。

发明内容

针对现有技术不足，提供一株提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株的构建方法及其应用。能很好地在木薯浓醪乙醇发酵生产中应用。

本发明的技术方案是：提供的一株提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株，该菌株为YM-27，分类学名为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，于2014年5月15日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2014206，保藏地址为武汉市武昌珞珈山武汉大学。

所述的提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤：PCR克隆酿酒酵母转录激活因子Msn4基因，连接入rDNA介导的多拷贝整合表达载体YPKR，构建rDNA介导、PGK酵母强启动子的高拷贝整合表达质粒YPKR-Msn4，线性化酶切重组表达质粒，将其转化导入到受体酵母菌株Y49的染色体中，获得工程菌株YM-27。

所述的提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株在木薯乙醇浓醪发酵生产中的应用。

本发明所述的整合型表达质粒YPKR，是以酿酒酵母整合载体YIp5为骨架，在其中引入特定的rDNA片段及G418抗性基因，同时引入酿酒酵母PGK强启动子，构建rDNA介导的多拷贝整合表达载体，以适用对酿酒酵母工业菌株的分子生物学操作，提高外源基因的稳定性和表达量。

本发明所述的受体酵母菌株Y49，由自行筛选的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y09tj(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号CGMCC NO.3476)诱变筛选获得。