[发明专利]一种用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法

说明书

技术领域

本发明属于生物蛋白酶检测技术领域，具体涉及一种用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法。

背景技术

酶谱分析技术是在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳的基础上发展而来的。酶谱分析技术是指使用含有底物蛋白的凝胶进行电泳或在电泳后将不含底物蛋白的凝胶浸泡在底物溶液中，再通过孵育、染色、脱色的方法显示经酶作用后底物蛋白的染色情况的变化，进而对酶活性进行定性分析。

虽然酶谱分析的方法常被用来检测蛋白酶类的活性，但现有酶谱技术仍然存在以下几点技术缺陷：

(1)目前的酶谱技术是在聚丙烯酰胺凝胶上检测到蛋白酶负染条带在聚丙烯酰胺凝胶上的位置，但经常由于底物背景过深而导致不能直接显示蛋白质Marker条带，因此难以通过酶谱分析直接确定未知蛋白酶的分子量。

(2)目前的酶谱分析技术分析蛋白酶的分子量时，一般需要制备两块凝胶，一块凝胶内配制了高浓度的底物蛋白，另一块胶不包含底物蛋白而用来分析蛋白质量标准(Protein Marker)；电泳结束后，含有底物蛋白的凝胶进行负染，而不含底物蛋白的凝胶直接进行考马斯亮蓝染色；染色结束后将两块胶进行比对，测定目标蛋白酶的分子量。但是凝胶中高浓度的底物蛋白会影响蛋白酶在胶中的迁移率，进而可能导致蛋白酶的分子量计算出现较大偏差。

(3)若采用将凝胶浸泡在底物溶液中的方法，容易导致蛋白酶的透明条带分辨率低，条带不够集中而清晰。

(4)目前的酶谱分析中在凝胶孵育过程中常用NaN₃作为防腐剂以避免产酶微生物对结果的影响，效果虽然很好但NaN₃的毒性很强,存在一定的危险性。

胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，生理pH和温度条件下胶原酶能够特异性地降解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而其他蛋白酶类则不具备此功能。胶原酶可以广泛应用于医学、食品、化妆品等工业生产中。医学研究中，常用胶原酶治疗腰间盘突出症、瘢痕疙瘩、血栓、溃疡、脓疮等疾病，它有不损伤胞膜及神经细胞且不破坏乳酪蛋白、血红蛋白、硫酸角质素等蛋白质的优点,治疗效果安全有效。工业应用中，常用胶原酶降解动物来源的胶原蛋白，其酶解产物易于被人体吸收与利用，添加至食品及化妆品中可改善人的体质及肤质。

胶原酶是一种底物特异性极高的蛋白酶，因为胶原酶与蛋白酶的底物完全不同，胶原酶具有较强的专一性，对其他类型蛋白水解能力差。目前的酶谱技术无法应用于胶原酶。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法,利用胶原酶对胶原蛋白的特异性降解作用对胶原酶进行酶谱分析。

为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

一种用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法，包括电泳和凝胶的处理步骤，所述电泳过程中所采用的凝胶为在10％SDS-PAGE凝胶中添加质量体积比浓度为0.1％的Ⅰ型胶原蛋白。

所述凝胶的处理过程为：电泳结束后先将凝胶用洗脱液在室温条件下振荡洗脱2次，随后用漂洗液在室温条件下振荡漂洗2次，最后将凝胶用孵育液在37℃下静置孵育12h；孵育结束后将凝胶先经质量体积比为0.1％的考马斯亮蓝R-250染色液染色1h，再经脱色液室温振荡脱色直至透明条带清晰；

所述洗脱液的组成为：由pH值为7.6、浓度为50mmol/L Tris-HCl缓冲液、聚乙二醇辛基苯基醚和CaCl₂组成，所含聚乙二醇辛基苯基醚的体积百分比为2.5％，CaCl₂的浓度为5mmol/L；

所述漂洗液的组成为：由pH值为7.6、浓度为50mmol/L Tris-HCl缓冲液和CaCl₂组成，CaCl₂的浓度为5mmol/L；

所述孵育液的组成为：pH值为7.6、浓度为50mmol/L Tris-HCl缓冲液、十二烷基聚乙二醇醚、NaCl和CaCl₂，其中，十二烷基聚乙二醇醚的浓度为0.02％，NaCl的浓度为200mmol/L、CaCl₂的浓度为5mmol/L；

所述考马斯亮蓝染色液的组成为：1L考马斯亮蓝染色液中含有1.0g考马斯亮蓝R-250、450mL甲醇和100mL冰醋酸；

所述脱色液的组成为：1L脱色液中含有100mL无水甲醇和100mL冰乙酸。