[发明专利]草莓皱缩病毒的快速检测试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及草莓皱缩病毒的RT-LAMP检测引物组、检测试剂盒及方法。

背景技术

草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus,SCV)分类学上隶属弹状病毒科(Rhabdoviridae)细胞质弹状病毒属(Cytorhabdovirus)。病毒粒体长约163-383nm，直径74-78nm，单分体基因组，-ssRNA，长2291bp。1932年在美国俄勒冈州草莓品种Marshall上首次被报道，1949年W.Prentice把草莓病毒3(Strawberry virus3)改名为皱缩病毒。病毒外壳由3个主要的结构蛋白组成，大小分别为78、47、25kDa。病毒侵染寄主植物后，存在于寄主的叶肉、表皮、韧皮部组织及未成熟木质部中，并在内质网池中形成病毒粒子聚集体。主要通过蚜虫持久性方式和嫁接传播，植株相互接触、种子和花粉不传播。该病毒在世界各地广泛分布，并存在株系分化现象。

草莓皱缩病毒在草莓各栽培区分布较广，危害较重。由于蚜虫传播等原因，病毒病害防治困难，因此，建立高效灵敏的检测技术，成为解决种苗检测、早期鉴定等问题的关键，为草莓栽培提供保障。草莓皱缩病毒的检测技术目前包括指示植物的小叶嫁接法和反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)等。小叶嫁接法周期长、灵敏度较低，反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测病毒灵敏度高，但需要特殊的仪器和试剂，检测时间较长，很难在农业生产单位和技术推广部门应用检测。

逆转录环介导等温扩增技术(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测病毒操作简便，不需要特殊的仪器和试剂，操作简单，可以在恒温条件下快速检测，不需要长时间的温度循环和昂贵的仪器，尤其是反转录和扩增反应都能在恒定温度下同时进行，降低了检测时间和成本。反应完成后，还可以通过荧光染色可以直接观察，能进一步减少时间。逆转录环介导等温扩增技术与其他病毒检测方法相比，快速、简便、灵敏，目前尚未有将逆转录环介导等温扩增技术在草莓皱缩病毒检测上的应用。

发明内容

本发明的目的是提供检测草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus,SCV)的专用引物以及特异性强、灵敏度高、易于操作、结果可靠的草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus,SCV)的快速分子检测试剂盒及方法。

本发明所提供的检测草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus,SCV)的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。

本发明还提供一种检测草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus,SCV)的试剂盒，包括所述的专用引物。

本发明所述专用引物在制备检测草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus,SCV)的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围

上述专用引物或试剂盒在鉴定草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus,SCV)病毒病中的应用也是本发明的保护范围。

本发明还保护一种检测草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus,SCV)或检测草莓草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus,SCV)病害发生危害的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测生物样本的基因组RNA；

(2)以步骤(1)的基因组RNA为模板，用所述的专用引物进行逆转录环介导恒温扩增；

(3)根据步骤(2)的扩增产物鉴定所述待测生物样本是否含有草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus,SCV)或者是否感染草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus,SCV)病害。

所述逆转录环介导恒温扩增的反应程序为：65℃30分钟，80℃10分钟。

所述逆转录环介导恒温扩增的反应体系中，序列表的序列1所示DNA和序列表的序列4所示DNA的浓度均为0.4μM，序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA的浓度均为0.2μM。