[发明专利]一种同时诊断HIV和口腔癌感染的毛细管电泳分离DNA探针法

说明书

技术领域

   本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种同时诊断HIV和口腔癌感染的毛细管电泳分离DNA探针法。

背景技术

人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV），顾名思义它会造成人类免疫系统的缺陷。该病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统失去抵抗力，从而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病，它是目前为止难以治愈的对人类健康威胁最大的传染性疾病。口腔癌是发生在口腔的恶性肿瘤之总称，大部分属于鳞状上皮细胞癌，即所谓的黏膜发生变异。在临床实践中口腔癌包括牙龈癌、舌癌、软硬腭癌、颌骨癌、口底癌、口咽癌、涎腺癌、唇癌、和上颌窦癌以及发生于颜面部皮肤黏膜的癌症等。口腔癌是头颈部较常见的恶性肿瘤之一。这两种疾病的产生都很人体内的基因变化有关，所以只要通过检测人体内这两种相关疾病的基因存在就可以对疾病作出诊断。

目前对HIV感染的检测方法主要是建立在对蛋白质的检测上，常见的方法有，抗体检测、免疫荧光-试验（IFA）、ELISA试剂检测和颗粒凝集实验法。所有的这些方法都是基于蛋白质为溶质的检测方法，它们有一个共同的缺点就是必须使用新鲜的样品，时间长的，变异的样品将无法检出，这就限制了这些方法在更大范围内的使用。此外抗体检测法周期很长；免疫荧光-试验（IFA）需要昂贵的荧光检测仪和有经验的专业人员来观察评判结果；ELISA试剂检测要求样本要新鲜；颗粒凝集实验特异性较差。

口腔癌是发生在口腔的恶性肿瘤之总称，是头颈部较常见的恶性肿瘤之一。目前对该疾病的诊断主要是通过目视法进行诊断，这对早期的口腔癌诊断是不利的。

目前对这些疾病的检测方法只能做到一种方法检测一种疾病，因而有较大的局限性，而且基于蛋白质检测的方法对样本的要求很高，要求样品新鲜，且要对身体不同部位进行采样。很多疾病是共生，而且有不少疾病是由于人体内的DNA产生改变而致病的，所以开发一种基于DNA检测技术的对这两种疾病同时检测的方法是有重大意义的。

  

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时诊断HIV和口腔癌感染的毛细管电泳分离DNA探针法，本发明是基于DNA检测技术与分离的同时诊断方法，解决了以下几个技术问题：1、DNA具有很强的稳定性，所以对样品的要求不高，可以使用采样时间很长的，乃至变质的样品进行检测；2、对于共生的这两种疾病，只要采集人体口腔粘膜的细胞就可以进行同时检测，不必抽血，不必从人体不同部位同时采集样本进行检测，采样简单。3、可以同时对两种疾病进行同时检测，检测时间可以缩短到两小时之内。4、检测的灵敏度极高，就算只有少量的样品也能够很灵敏地检测出致病DNA。5、经过PCR扩增和探针双重筛选，具有极强的特异性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种同时诊断HIV和口腔癌感染的毛细管电泳分离DNA探针，所述的DNA探针序列为：5’-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3’和5’-GGAGAAGTTTTTGAAGACGGC TGA-3’。

在所述探针上面标记上羧基荧光素，使之具有荧光信号。

一种同时诊断HIV和口腔癌感染的毛细管电泳分离DNA探针的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）样品处理：用棉签从人体口腔内无痛刮取粘膜细胞，置于试管，加入水，反复挤压棉团让细胞脱落，离心，去除上清液加TE溶液，煮沸，冰浴后，震荡离心，取上清液进行PCR扩增特定的DNA片段；

（2）设计两段分别与步骤（1）中已知的HIV和口腔癌DNA片段互补的DNA，在这两段DNA上面标记上羧基荧光素使之具有荧光信号，这两段DNA为HIV和口腔癌的DNA探针；

（3）采用毛细管胶束电动色谱法，首先对所述DNA探针进行分离，经过条件优化以后，两条HIV和口腔癌的探针峰得到分离，分别标记为1和2；若同时感染这两种疾病，当把探针加入经过以上处理过的样品中以后，HIV及口腔癌的DNA探针就会特异性地和PCR扩增后HIV及口腔癌的DNA互补片段产生杂化并生成双链DNA，这样溶液中就多了两个会发光的样品，通过色谱图，根据后面出现的双链杂化峰判定是否有感染。

步骤（1）中扩增的片段序列必须要包含HIV和口腔癌的DNA片段各一种；且所述的包含HIV和口腔癌的DNA片段的序列分别为：5’-ATGTGG AAA ATCTCTAGCAGT-3’ 和5’-TCAGCCGTCTTCAAA AACTTCTCC-3’。