[发明专利]一种用于制备肝细胞靶向转递小干扰RNA的方法

说明书

本发明属于生命科学领域，具体涉及一种用于制备肝细胞靶向转递小干扰RNA的方法。本发明公开了一种用于制备肝细胞靶向转递小干扰RNA的方法，反应底物包括乳糖酸或半乳糖衍生物、末端氨基修饰RNAi多核苷酸和EDC，其中，乳糖酸或半乳糖衍生物作为耦合反应的羧基供体和靶向耦合物的半乳糖基供体，末端氨基标记RNAi多核苷酸作为耦合反应的伯氨基供体，EDC作为零长度交联剂。本发明所公开的方法操作简便、产率高、活性好，实现了小干扰RNA与肝细胞特异性配基―半乳糖基的共价耦合，耦合物被肝细胞特异性摄取后，表现出针对目标基因的沉默活性。

技术领域

本发明属于生命科学领域，具体涉及一种用于制备肝细胞靶向转递小干扰RNA的方法。

背景技术

RNA干扰(RNAi)为由一类小干扰RNA分子介导的转录后基因沉默现象，广泛应用于基因功能鉴定和基因治疗研究领域。小干扰RNA分子通常是由19～23对碱基构成的双链结构，分子量13～15kd，携带38～40个净负电荷，因此小干扰RNA裸分子自身无法穿越负电荷细胞膜，常需要阳性脂质体包裹携带转染细胞。此外，小干扰RNA系统使用时，其生物分布十分广泛，在肝、肾、心、脾、肠等多脏器广泛分布，造成靶组织内RNAi活性不足，补偿性加量后易出现靶外基因沉默、免疫刺激和miRNA竞争抑制等副作用。因此，小干扰RNA药物转化的主要障碍在于缺乏理想的高效细胞靶向转递手段。

肝脏作为人体的重要代谢器官，易受病毒感染、代谢性疾病、肿瘤等的侵害。提高小干扰RNA裸分子靶向进入肝细胞是加快RNAi治疗肝疾时药物转化的关键。目前，协助小干扰RNA肝细胞靶向转递媒介物大体可分为病毒载体和非病毒载体两类。前者转染效率高，其靶向性的实现可通过肝细胞特异性启动子获得，但免疫排斥反应和基因重组风险限制其临床转化。非载体类靶向转递可以借助阳离子复合物(脂质体或多聚体)或化学修饰等手段，将有肝细胞特异识别能力的配基以共价键或非共价键的方式与小干扰RNA结合得以实现。其中，非共价键结合是小干扰RNA肝细胞靶向转递研究的常见技术。

非共价键结合小干扰RNA靶向复合物优势在于方法灵活多样，不改变小干扰RNA分子结构，体外研究结果较为理想。如Oishi(2007年)将半乳糖化聚乙二醇和多聚赖氨酸形成非共价键复合体，依靠静电携带小干扰RNA(颗粒直径110nm)。体外示踪表明复合物顺利地转入了Huh7细胞。再如，Kim(2007年)将脂质体、胆固醇、载脂蛋白apoA-Ⅰ静电结合小干扰RNA，形成小干扰RNA非共价键复合物，体外转递肝细胞，其摄取量是无apoA-Ⅰ的3倍。Sato(2007年)利用半乳糖化胆固醇衍生物(C4-chol)与中性脂质体DOPE及小干扰RNA非共价键结合成75.3±5.8nm的复合物颗粒，体内实验表明约80％的小干扰RNA复合物分布于肝实质细胞。

非共价靶向小干扰RNA复合物不足在于非共价键导致结构不稳定，易降解；直径过大(＞50nm)，难以通过毛细血管壁，容易被肝Kupffer细胞清除；激活补体系统，易被网状内皮系统清除；药代指标不理想，药物转化空间不大。

配基与小干扰RNA依靠共价键结合后肝细胞转递的优势明显，形成的耦合物分子均质，可控性好，容易纯化。配基化小干扰RNA单分子直径小，容易通过肝血窦毛细血管壁，药代学指标清晰。如，利用胆固醇主要在肝脏代谢的特点，Lorenz和Soutschek(2004年)将胆固醇与小干扰RNA正义链5’端共价耦合后发现，稳定性明显提高(半衰期95min，血浆清除率0.5mL/min)。虽然其在心、肺、脂肪等多组织器官均有分布，但以肝脏和空肠摄取最多。再如，Rozema(2007年)以半乳糖胺为配基，将丁基-氨基-乙烯醚聚合物通过侧链羧基二甲基酐键与聚乙二醇和N-乙酰半乳糖胺共价连接后，与小干扰RNA5’端二硫键共价结合，形成大小为10nm的单分子化合物。体外转染证实其具有与阳性脂质体siQUEST相同的肝细胞转染效率，可降低目标基因表达80％。体内主要分布在肝细胞，只少量被肝窦非实质细胞和肾、脾摄取。

配基与小干扰RNA共价键结合相关技术较少见诸报道，主要障碍在于耦联反应条件要求较高，需要设计更为简便、巧妙的中间桥联分子。