[发明专利]一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的分离筛选方法

权利要求书

1.一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的分离筛选方法，其特征是：包括如下步骤：

（1）采集土壤样品：采集地表以下5cm处的土壤为样品；

（2）样品预处理：取上述土壤样品装入已灭菌并盛装有无菌水的容器中，密封后剧烈震摇10min，静置悬浮液，取上清液离心2min后，取上层菌液为菌悬液，备用；

（3）扩大培养：分别取菌悬液10μL接种于250mLLB培养液中，置于37℃恒温箱中培养震荡72h，得扩大菌种培养液；

（4）逐级梯升温阶筛选：取10μL扩大菌种培养液接种于250mLLB培养液中，按温度逐级递升进行培养，即后一温阶所用接种菌液取自前一温阶培养的菌液；

（5）选定耐高温菌群：在培养温度下，观察接种菌液后的LB培养液，如出现浑浊，则判定该菌可在此温度下生长，反之则排除；

（6）选定耐高温菌株：取耐50℃以上的菌液，以生理盐水稀释（10^-6），并均匀涂布于富氮培养基内，37℃培养48h；挑取有不同形态特征的单菌落，于37℃富氮培养基上分别扩繁后，以完全营养液体培养基加20%甘油混匀，于-80℃条件下保存；

（7）采用尼罗蓝染色法，分别取耐50℃以上具不同形态特征的单菌落，接种于LB培养基培养12h；步骤（6）的耐高温菌株经适当扩繁后稀释（10^-6）涂布筛选培养基，于30℃条件下培养36h后，在365nm紫外灯照射下呈橘粉色菌落，即产PHB高的菌株，目标菌株再以富氮培养基37℃扩繁后，以完全营养液体培养基加20%甘油混匀，于-80℃条件下保存，得耐高温、产PHB高的菌群。

2.根据权利要求1所述的细菌，其特征是：步骤（3）所述的培养震荡的震荡频率为100r/min。

3.根据权利要求1所述的细菌，其特征是：所述富氮培养基由酵母浸粉10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L加蒸馏水定容至1L制成。