[发明专利]一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的分离筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，具体是一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌（PHB）的分离筛选方法。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxybutyrate，PHB)是一种细胞内聚酯,具有生物降解性，为生物可降解塑料的新型高分子材料。

目前PHB的生产方法有微生物合成和转基因植物合成；转基因植物合成PHB降低生产成本尚未成功；利用微生物合成PHB的生产成本相对较高，主要是由于高的发酵底物价格及提取纯化费用。

工业上主要采用两步法培养微生物（有氧/富氮和贫氧/贫氮）来获得PHB，控制氧含量的方法为单纯的氧浓度控制（主要是灌注纯氮）在成本、设备、工艺上要求很高。

发明内容

本发明的目的是要提供一种耐高温、产聚羟基丁酸酯（PHB）多的细菌分离筛选方法。

本发明耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的分离筛选方法，是采用梯度增温分离方法筛选得到的，其方法包括如下步骤：

（1）采集土壤样品：采集地表以下5cm处的土壤为样品；

（2）样品预处理：取上述土壤样品装入已灭菌并盛装有无菌水的容器中，密封后剧烈震摇10min，静置悬浮液，取上清液离心2min后，取上层菌液为菌悬液，备用；

（3）扩大培养：分别取菌悬液10μL接种于250mLLB培养液中，置于37℃恒温箱中培养震荡72h，得扩大菌种培养液；

（4）逐级梯升温阶筛选：取10μL扩大菌种培养液接种于250mLLB培养液中，按温度逐级递升进行培养，即后一温阶所用接种菌液取自前一温阶培养的菌液；

（5）选定耐高温菌群：在培养温度下，观察接种菌液后的LB培养液，如出现浑浊，则判定该菌可在此温度下生长，反之则排除；

（6）选定耐高温菌株：取耐50℃以上的菌液，以生理盐水稀释（10^-6），并均匀涂布于富氮培养基内，37℃培养48h；挑取有不同形态特征的单菌落，于37℃富氮培养基上分别扩繁后，以完全营养液体培养基加20%甘油混匀，于-80℃条件下保存；

（7）采用尼罗蓝染色法，分别取耐50℃以上具不同形态特征的单菌落，接种于LB培养基培养12h；步骤（6）的耐高温菌株经适当扩繁后稀释（10^-6）涂布筛选培养基，于30℃条件下培养36h后，在365nm紫外灯照射下呈橘粉色菌落，即产PHB高的菌株，目标菌株再以富氮培养基37℃扩繁后，以完全营养液体培养基加20%甘油混匀，于-80℃条件下保存，得耐高温、产PHB高的菌群。

步骤（3）所述的培养震荡的震荡频率为100r/min。

所述富氮培养基由酵母浸粉10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L加蒸馏水定容至1L制成。

本发明分离筛选得到的耐高温产聚羟基丁酸酯细菌，属蜡样芽胞杆菌，革兰氏阳性，于2014年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国·武汉·武汉大学），保藏号为CCTCCNO：M2014179。该菌株形态特征为：短杆状，长1~1.5μm。

经检测，该耐高温产PHB细菌可以耐受60℃的高温，且产PHB的产率高，，且最适生长温度为55℃，其合成PHB的最高产率为2.276g/L，最适生长pH值为7-7.5。

本发明的优点是：由于该耐高温产PHB细菌可以耐受60℃的高温，因而可以很方便地通过控制温度进而控制氧浓度，降低生产工艺和设备要求；可以在很简单的发酵设备（如无防杂菌污染装置）中，利用高有机质含量的蔗糖、木薯工业废水作为碳源生长和合成PHB，降低设备投入及发酵底物成本；还可以通过提高温度杀死其他非耐高温细菌，从而保证目标菌体单一性，并提高其生物量和所提取的PHB纯度。

附图说明

图1为GXNUHT-PHB-1菌落自然光下形态图；

图2为GXNUHT-PHB-1菌落尼罗蓝染色自然光下形态图；

图3为GXNUHT-PHB-1菌落尼罗蓝染色紫外光下形态图；

图4为GXNUHT-PHB-1革兰氏染色显微镜观察图；

图5为基于16SrRNA基因序列以Neighbor-Joining法构建的系统发育树；

图6为GXNUHT-PHB-1胞内PHB的红外光谱图；

图7为GXNUHT-PHB-1产物的1H-NMR图；

图8为GXNUHT-PHB-1产物的1C-NMR图。