[发明专利]一种去除胰蛋白酶中的内毒素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种去除胰蛋白酶中的内毒素的方法。

背景技术

胰蛋白酶是动物胰脏所分泌的一种重要的蛋白水解酶，能水解蛋白质和多肽，可以选择性的水解精氨酸和赖氨酸的肽链，为一肽链内切酶，对各种炎症、溃疡、脓汁、血肿、脓胸、皮肤以及消化组织细胞等疾病具有间接和直接的治疗作用。作为一种肌内注射药品，为保障其临床应用安全性，需对其内毒素含量进行控制。内毒素产生于革兰氏阴性细菌的细胞外壁，其主要成份是脂多糖(LPS)及类脂A，是热原的活性部分。它们的相对分子质量一般为1万～2.5万，在水溶液中形成缔合体，相对分子质量可达50万～100万。其具有耐热性和化学稳定性，不易被除灭。注入人体的注射剂中含有热原量达1μg/kg就可引起不良反应，发热反应通常在注入1小时后出现，可使人体产生发冷、寒颤、发热、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃以上，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。因此，在生物制品生产过程中，需要有严格的工艺控制策略对内毒素进行去除或限量控制。

目前，水溶液中常用的内毒素去除方法主要有如下几种：

1、超滤

内毒素具有较大的相对分子质量，因此，可选用超滤膜去除水中的内毒素。在使用超滤方法去除内毒素时需要根据被处理药物的相对分子质量、特性选择超滤膜的孔径及材质，因此该方法不具备通用性。另外，内毒素并不以单一分子存在，而是以相对分子质量不等的集聚体存在，因此大小不一，这也给超滤法去除内毒素带来了挑战。

2、活性炭吸附法

活性炭吸附是一种较早用于内毒素去除的方法，但是，由于活性炭选择性差，在吸附内毒素的同时吸附有效活性成分，影响产品收率。

3、化学降解法

化学降解法是指用强酸、强碱或氧化剂等使内毒素降解以达到去除内毒素的目的，这种方法有可能造成有效成分的降解或失活，因此，该方法的使用需结合产品的理化性质。

4、离子交换色谱法

离子交换色谱法是根据内毒素带有部分负电荷的性质，用阴离子交换色谱来去除内毒素，但这种方法不适合于溶液中存在其它带负电荷物质的情况。

蛋白质种类较多，其分离纯化步骤各不相同，不同终产品对内毒素含量要求也有差异，因此，去除内毒素的方法和效果无法完全通用。胰蛋白酶作为一种活性蛋白酶类药物，其具有易失活、不稳定的特点，在内毒素去除过程中保证其本身性质及有效活性成分不受影响至关重要，这也是本领域长期以来存在的、难以克服的技术难题。在胰蛋白酶内毒素去除方法选择过程中，超滤法因胰蛋白酶分子量较大而无法应用，活性炭吸附法专一性不强，化学降解法极易造成胰蛋白酶失活，色谱法耗时较长，不利于胰蛋白酶稳定。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有技术中胰蛋白酶中的内毒素无法去除彻底、易造成胰蛋白酶失活、耗时较长的缺陷，而提供了一种去除胰蛋白酶中的内毒素的方法。本发明的方法将超滤与磷酸钙沉淀联合使用，可以有效除去内毒素，且不会影响胰蛋白酶的活性，适用于大规模条件下除去蛋白质中的内毒素。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：

本发明提供了一种去除胰蛋白酶中的内毒素的方法，其包括下述步骤：将胰蛋白酶滤饼溶解于水中，超滤浓缩得到浓缩液，依次加入磷酸盐水溶液和钙盐水溶液，调节pH值为8～9，离心，即可。

其中，所述的胰蛋白酶滤饼可为本领域常规的胰蛋白酶处理方法得到的胰蛋白酶滤饼，一般经过多步盐析、结晶、过滤、活化、盐析得到，较佳地通过下述步骤得到：将胰蛋白酶原料用水溶解，加入硫酸调节pH值为2～3，加入饱和硫酸铵溶液盐析，加入硼酸缓冲液调节pH值为7.5～7.7，再加入胰蛋白酶进行活化，用硫酸调节pH值为2.5～3.5，加入固体硫酸铵进行盐析，即得到胰蛋白酶滤饼。