[发明专利]一种通过调控gln1基因表达提高S‑腺苷甲硫氨酸产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地，本发明涉及一种通过调控gln1基因表达提高S-腺苷甲硫氨酸产量的方法。

背景技术

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)由Cantoni等人于1952年发现，作为所有生物体内的重要甲基供体，并参与多种代谢反应，SAM在抑郁症、肝脏疾病和关节炎治疗领域都具有良好的临床应用价值。因此，越来越多的研究人员利用代谢工程改变细胞的代谢途径以获得高产SAM的菌株。

在生物体内，以L-Met和ATP为前体，可经SAM合成酶(MAT)催化合成SAM(图1)。其反应过程为，ATP的腺苷部分与L-Met的硫原子部分发生撞击，使得腺苷结构与甲硫氨酸相结合，从而生成具有高能量的有机硫化物。

上述提高SAM合成酶活性是获得SAM高产菌的一个重要策略。经研究发现在生物体内存在两种SAM合成酶，它们是同工酶，编码基因分别为sam1和sam2，sam1编码SAM合成酶I是受产物抑制的，而sam2编码的SAM合成酶II不受产物抑制，所以提高sam2基因的表达可以提高SAM合成酶的含量。因此人们利用受甲醇诱导的强启动子AOX或者组成型的GAP调控sam2的表达，李东阳等将sam2基因导入pPIC3.5K转化毕赤酵母GS115使得SAM合成酶酶活提高了37倍，SAM最终产量达到了1.58g/L。Yu等(Yu ZL,Wu XJ,Li DY,et al.Enhancement of the production of SAM by overexpression of SAM synthetase in Pichia pastoris.Acta Biochimica et Biophysica Sinica.2003,35:127–132)利用组成型的GAP启动子调控SAM合成酶，导入GS115使得SAM产量显著提高。

除了提高SAM合成酶的表达量，还能对SAM合成酶进行体外进化，以获得高酶活的重组酶。本发明人前期工作中(Hu H,Qian JC,Chu J,et al.DNA shuffling of methionine adenosyltransferase gene leads to improved S-adenosyl-L-methionine production in Pichia pastoris.J Biotechnol.2009,141(3):97-103)利用DNA Shuffling技术对SAM合成酶进行了体外进化，经过筛选获得高酶活重组SAM合成酶基因ds16和相应的高产菌株DS16。在摇瓶中，DS16的胞内SAM累积量为1.64g/L，SAM合成酶的酶活达到463U/g DCW，与表达酵母SAM合成酶的重组菌相比，分别提高了102％和201％，有效改善了胞内SAM合成酶活性对SAM合成的限制。

本发明人前期工作中，利用易错PCR对GAP启动子进行突变，筛选得到了强度不一的启动子，可对毕赤酵母内的基因表达进行有效调控。应用弱启动子弱化cys4基因表达，使其克服营养缺陷型的缺点，得到一株SAM高产菌G12-CBS。通过摇瓶培养产量达到了133.2mg/gDCW，在5L罐中重组菌G12-CBS的SAM单位菌体产量达到了146.8mg/gDCW。相比出发菌DS16，其单位菌体产量提高了39.3％，体积产量提高了48.8％。从发酵成本来看，G12-CBS消耗的外源L-Met量与出发菌株相比减少了15％，其L-Met转化率达到34.6％，比DS16(19.4％)提高了78％。

以上改造都是基于对SAM相关代谢局部途径的认识来选择改造靶点的。但是，由于微生物代谢网络的系统性和复杂性，从局部代谢途径出发的改造往往具有一定的局限性。为了克服这一问题，本领域技术人员还需利用系统生物学的方法对细胞生理特性进行分析，从全基因组范围寻找影响目标产物合成的改造靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过调控gln1基因表达提高S-腺苷甲硫氨酸产量的方法。

在本发明的第一方面，提供一种生产S-腺苷甲硫氨酸的方法，所述方法包括：

(1)在S-腺苷甲硫氨酸生产菌株的基因组中引入外源的谷氨酰胺合成酶(GLN1)表达盒；

(2)培养步骤(1)制备的菌株，从而生产S-腺苷甲硫氨酸。

在一个优选例中，所述的谷氨酰胺合成酶表达盒包括以下操作性连接的元件：AOX1启动子、编码谷氨酰胺合成酶的基因、转录终止序列(较佳地为TT)。