[发明专利]运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体pSUZM系列及其构建方法

权利要求书

1.一类能在运动发酵单胞菌-大肠杆菌中穿梭的环状载体pSUZM1、pSUZM2和pSUZM3，包含两个原核复制起点，筛选标记基因。

2.根据权利1所述的载体，其特征在于：pSUZM1包含来自于运动发酵单胞菌染色体上复制起点oriC和来自于质粒pUC18上的大肠杆菌质粒复制起点，卡那霉素筛选标记基因；pSUZM2包含来自于运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401的复制起点、DNA复制蛋白基因序列和来自于质粒pUC18上的大肠杆菌质粒复制起点、卡那霉素筛选标记基因；pSUZM3包含来自于运动发酵内源性质粒pZZM402上的复制起点、DNA复制蛋白基因序列和来自于质粒pUC18上的大肠杆菌质粒复制起点、卡那霉素筛选标记基因。

3.权利2所述的载体的构建方法，包括如下步骤：

1）pSUZM1的构建方法，包括如下步骤：

(1)以CTAB法分别提取运动发酵单胞菌DNA；

(2)以运动发酵单胞菌全基因组DNA为模板，用以下引物5’-GGCACGACAGGTTTCCTCTTCGACCAGCGGTAAG-3’和5’-CCCACTGCAAGCTACCTTCAGTCGCGGCTTCTACC-3’进行PCR扩增，得到运动发酵单胞菌复制起点片段oriC；

(3) 以载体pUC18模板，用以下引物5’-GGGCTTCGGAATCGAGGATCTAGGTGAAGATCC-3’和5’-CTTACCGCTGGTCGAAGAGGAAACCTGTCGTGCC-3’，进行PCR扩增，得到大肠杆菌质粒复制起点片段oriE-1；

(4)以载体pBBR1MCS-2为模板，用以下引物5’-GGTAGAAGCCGCGACTGAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3’和5’-GGATCTTCACCTAGATCCTCGATTCCGAAGCCC-3’，进行PCR扩增，得到筛选标记基因片段kan-1；

(5）将3个PCR产物oriC、oriE-1和kan-1分别经电泳凝胶回收后等摩尔混合，混合片段用T4 DNA聚合酶进行处理，然后进行退火反应重组，转化大肠杆菌，获得权利要求2所述的载体pSUZM1；

2)pSUZM2的构建方法，包括如下步骤：

(1)以CTAB法分别提取运动发酵单胞菌DNA；

(2)以运动发酵单胞菌全基因组DNA为模板，用以下引物5’-GGCACGACAGGTTTCCGCACCGCAAAGGACATG  -3’和5’- CCCACTGCAAGCTACCTCGATTAACCGCAGGATTACG -3’进行PCR扩增，得到运动发酵单胞菌质粒pZZM401的复制起点和DNA复制酶基因片段oriP1；

(3)以载体pUC18模板，用以下引物5’-GGGCTTCGGAATCGAGGATCTAGGTGAAGATCC -3’和5’- GCATGTCCTTTGCGGTGCGGAAACCTGTCGTGCC -3’，进行PCR扩增，得到大肠杆菌质粒复制起点片段oriE-2；

(4)以载体pBBR1MCS-2为模板，用以下引物5’-CGTAATCCTGCGGTTAATCGAGGTAGCTTGCAGTGGG -3’和5’- GGATCTTCACCTAGATCCTCGATTCCGAAGCCC -3’，进行PCR扩增，得到片段kan-2；

(5)将3个PCR产物oriP1、oriE-2和kan-2分别经电泳凝胶回收后等摩尔混合，混合片段用T4 DNA聚合酶进行处理，然后进行退火反应重组，转化大肠杆菌，获得权利要求2所述的载体pSUZM2；

3) pSUZM3的构建方法，包括如下步骤：

(1)以CTAB法分别提取运动发酵单胞菌DNA；

(2)以运动发酵单胞菌全基因组DNA为模板，用以下引物5’-GGCACGACAGGTTTCCCGGAAAGGTCATCCTG -3’和5’- CCCACTGCAAGCTACCTCTGAGGCGACGACAG -3’进行PCR扩增，得到运动发酵单胞菌质粒pZZM402的复制起点和DNA复制酶基因片段oriP2；

(3)以载体pUC18模板，用以下引物5’-GGGCTTCGGAATCGAGGATCTAGGTGAAGATCC -3’和5’- CAGGATGACCTTTCCGGGAAACCTGTCGTGCC -3’，进行PCR扩增，得到大肠杆菌复制起点片段oriE-3；

(4)以载体pBBR1MCS-2为模板，用以下引物5’-CTTCTGTCGTCGCCTCAGAGGTAGCTTGCAGTGGG -3’和5’- GGATCTTCACCTAGATCCTCGATTCCGAAGCCC -3’，进行PCR扩增，得到片段kan-3；

(5)将3个PCR产物oriP2、oriE-3和kan-3分别经电泳凝胶回收后等摩尔混合，混合片段用T4 DNA聚合酶进行处理，然后进行退火反应重组，转化大肠杆菌，获得权利要求2所述的载体pSUZM3。