[发明专利]运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体pSUZM系列及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体pSUZM1、pSUZM2、pSUZM3及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

能源安全和环境问题作为全世界共同关注的焦点，燃料乙醇作为一种优良的可替代能源引起了研究者的广泛关注。运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis，Z.mobilis)在生物技术领域的应用前景越来越受到广泛关注，它不仅可用于生产重要的化工产品，而且可用于产生燃料乙醇。与酿酒酵母和其他燃料乙醇基因工程菌相比较，运动发酵单胞菌具备许多突出的优点，比如吸收糖效率高，产生物量少; 发酵时无需控制加氧; 耐高渗透压和易于基因操作; 乙醇耐受性强，理想的乙醇产量等等。但是，运动发酵单胞菌也具有一些不足之处，如底物范围过窄，不能利用复杂的碳水化合物转化为乙醇。除此之外，该细菌在发酵时对醪液中的盐类﹑pH﹑抑制剂比较敏感，因而需对生产过程进行严格控制。为满足对该菌的基础研究和工业应用的要求，需要创建不同的基因工程菌株，因此首先需要有优良的载体系统。

基因组DNA的复制对于一个细胞来说是极其重要的。原核生物的基因组具有一个或多个染色体，且多为环形，真细菌染色体的复制起点仅有一个，古细菌的染色体复制起点则为单个或多个。其中，真细菌的复制起始位点（oriC）片段长度从100bp到1000bp不等，染色体从此处开始复制，以双复制叉的形式前行，在复制终点(terC)结束。绝大多数细菌的oriC位点位于dnaA基因附近，个别位于gidA和rpmH基因之间，或者靠近hemE基因。

细菌质粒主要有theta (θ)和滚环两种复制形式，θ型复制与细菌基因组复制形式相似，由RNA 聚合脢(RNA polymerase)和DNA聚合脢(DNA polymerase)共同作用，以双复制叉的形式向两端进行延伸。滚环复制与部分噬菌体的复制形式相似，质粒双链中的一条链在复制起始位点区被质粒编码起始蛋白（plasmid-encoded initiator-protein,Rep）切开，然后环状链和线状链分别进行复制。滚环复制质粒最早是在Staphylococcusaureus中被发现，随后在Bacillus subtilis, Clostridium butyricum, Brevibacteriumlactofermentum等革兰氏阳性菌中均有发现，而Zymomonasmobilis，Bacteroides, cyanobacteria，Helicobacter pylori等革兰氏阴性菌中质粒的复制也属于该复制形式。滚环复制质粒的大小从1.3kb到10kb不等，具有精简的结构，质粒上基因的转录方向大多相一致。Arvanitis等对Z.mobilis 10988内源性质粒pZMO1和pZMO2的特征和复制相关组分进行了研究，将质粒pZMO1线性化后克隆到pUC19中测序，全长为1651 bp，G+C含量为38%，其中开放阅读框(ORFZMO1)编码348个氨基酸，与其他革兰氏阴性菌滚环复制质粒的复制蛋白高度同源。质粒pZMO2全长为1669 bp，G+C含量为38.5，开放阅读框(ORFZMO2)编码184个氨基酸，其N-端与滚环复制质粒的复制蛋白高度同源。

运动发酵单胞菌自身的不足限制了其在基础研究和生物技术领域的应用，其中一个主要的瓶颈便是缺乏基因工程菌株。为了获得乙醇生产效率高且又能利用多种碳源的运动发酵单胞菌基因工程菌，最为有效的方法是对其进行遗传改造，常规的遗传方法是利用载体携带感兴趣的外源基因，其编码的蛋白质使运动发酵单胞菌获得相应的功能。运动发酵单胞菌现有的常用载体主要有，光谱载体pBBR1MCS系列和RSF1010系列等，但这些载体均有一定的缺陷，其中pBBR1MCS系列存在结构稳定性，而载体RSF1010系列则载体偏大。因此，将运动发酵单胞菌内源性质粒和大肠杆菌的质粒进行有效整合后形成大小较为合适的穿梭载体，这种类型的载体既能在大肠杆菌中复制，又能在运动发酵单胞菌中复制，且在运动发酵单胞菌中能够稳定的遗传，具有很好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体pSUZM1、pSUZM2和pSUZM3及其构建方法。

本发明提供的运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体pSUZM1、pSUZM2和pSUZM3是一类环状载体。

其中复制载体pSUZM1包含来自于运动发酵单胞菌染色体上复制起点oriC、来自于质粒pUC18上的大肠杆菌质粒复制起点，卡那霉素筛选标记基因。