[发明专利]胃泌素释放肽前体定量测定试剂盒、其制备方法及检测方法

权利要求书

1.一种胃泌素释放肽前体定量测定试剂盒，包括盒体（1）和盒体上方的盒盖（2），其特征是：所述盒体（1）内设有微孔板（6）和位于盒体（1）底部的支撑板（3），支撑板（3）上开有多个孔（4），所述孔（4）内共放置有八个试剂瓶（5），八个试剂瓶（5）分别含为磁分离试剂瓶、酶反应物瓶、稳定增强剂瓶、校准品瓶、质控品瓶、清洗浓缩液瓶、稀释液瓶以及底物溶液瓶。

2.根据权利要求1所述的胃泌素释放肽前体定量测定试剂盒，其特征在于：所述微孔板（6）上设置48或96个微孔（7）。

3.根据权利要求1或2所述的胃泌素释放肽前体定量测定试剂盒，其特征在于：所述磁分离试剂瓶内含有胃泌素释放肽前体单克隆抗体包被的磁颗粒。

4.制备权利要求1所述的一种胃泌素释放肽前体定量测定试剂盒的方法，其特征在于：所述试剂瓶中试剂准备过程如下：

步骤一、磁分离试剂的制备

一、磁珠缓冲液配制

（1）、称取TRIS 4.58g和NaCl 6.81g于1L容器中，然后称取0.96g 吐温20于20mL容器中加适量水使其完全溶解后，再倒入上述1L容器中；

（2）、用移液器将防腐剂量取0.2mL于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中，然后在上述1L容器中加入 800mL纯化水，充分搅拌；

（3）、调节pH计测量其pH值，控制pH在7.95-8.05之间；

（4）、称取BSA 3g倒入上述1L容器中；

（5）、最后1L容器定容至 1000mL，用0.2μm滤器过滤；过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存；

二、磁分离试剂的制备

（1）、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50μL DMSO中，取2mg抗ProGRP单克隆抗体溶于pH 9.5的0.1mol/L的PB缓冲液中至总体积为1mL；

（2）、确定辛二酸二琥珀酰亚胺酯的投入量，用移液枪吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到上述ProGRP单克隆抗体溶液中，置室温90min；

（3）、然后将抗体溶液加入到浓缩管中，放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0.5mL；

（4）、取0.5mL磁珠加入5mL反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2min后吸取上清；

（5）、每次加入1.5mL pH9.5的0.1mol/L的PB缓冲液，混匀30s，上架，去上清，重复操作3次；将获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4h；

（6）、加入0.3mL1mol/L的TRIS溶液37℃15min；

（7）、每次加入1.5mL pH7.2的0.1mol/L的PB缓冲液清洗已经标记的磁珠，混匀30s，上架，去上清，重复操作3次；

（8）、用100mL磁珠保存液将磁珠转入125mL玻璃瓶，即为0.05％的ProGRP磁分离试剂；磁珠保存液配方为0.1％BSA，0.05％Tween-20，0.02％NaN₃，20％乙醇，4℃保存；

（9）、将获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1:1的比例混匀，即得磁分离试剂；

步骤二、酶反应物的制备

步骤三、反应增强剂的配制

（1）、称取TRIS 1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中；用移液器将 Proclin-300量取0.2mL于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L容器中；

（2）、用量筒量取800mL纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解，然后调pH值，控制pH在 7.35-7.45之间；

（3）、称取阻断剂 0.9g于上述1L容器中；最后定容至1000mL，完全溶解后，用0.2μm滤器过滤；

步骤四、校准品稀释液的配制

步骤五、校准品和质控品的配制

步骤六、清洗浓缩液的配制

（1）、称取KCl 4g、NaCl 40g、蔗糖10g于1L容器中；

（2）、称取0.225g Tween-20于100mL容器中加15mL水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；

（3）、用移液器将防腐剂量取0.225mL于盛有15mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；

（4）、用量筒量取800mL纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解；

（5）、调pH，控制其范围在7.35-7.45之间；

（6）、最后定容至1000mL，完全溶解后用0.2μm滤器过滤即得；

步骤七、底物溶液的配制

一、底物溶液A的配制步骤

（1）、称取硼砂5.721g、硼酸2.474g、鲁米诺1.0g和对碘苯酚0.1mg于1L烧杯中；

（2）、用量筒量取400mL纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调pH，控制其范围在7.95-8.05之间；

（3）、用0.2μm滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至500mL，混匀后即得；

二、底物溶液B的配制

（1）、称取硼砂5.721g、硼酸2.474g、过氧化脲0.1g和防腐剂250μL于1L烧杯中；

（2）、用量筒量取400mL纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调pH控制其范围在7.95-8.05之间；

（3）、用0.2μm滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至500mL，混匀后即得。

5.使用权利要求4制备的胃泌素释放肽前体试剂盒进行检测的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

（一）样品的前处理：

    使用本试剂盒进行实验前，需先取出辣根过氧化物酶标记的ProGRP抗体、校准品/待测样品、ProGRP抗体磁颗粒、发光底物液和洗涤液，在室温放置15-30min，使它们平衡到室温；之后，将恒温箱或者水浴锅调至37℃；准备好合适的微量加样器及对应吸头并且检查化学发光仪是否工作正常；

    （二）操作步骤：

（1）、加50μL胃泌素释放肽前体校准品、质控品、待测标本至对应微孔底部；

（2）、加50μL酶反应物至每一微孔中；

（3）、加50μL反应增强剂至每一微孔中；

（4）、加50μL磁分离试剂至每一微孔中；

（5）、用塑料薄膜覆盖微孔，多管混匀器轻轻振荡微孔板30s后，置37℃水浴30min；

（6）、微孔板放至磁分离器上，确保每个微孔都与分离器表面接触，沉淀2min；缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的微孔板连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在微孔上的所有液滴；

（7）、清洗浓缩液用纯化水稀释20倍后，加200μL稀释后的清洗液至每一微孔中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s；加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出，且混匀要彻底；

（8）、重复步骤（6）、（7）、（6）一遍；

（9）、加100μL底物溶液至微孔中混匀3s，迅速用准备好的发光检测仪进行检测；

（10）、以校准品浓度的Log值为横坐标，RLU的Log值为纵坐标绘制出双对数标准曲线，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的ProGRP的浓度，其中纵坐标为发光强度，横坐标为ProGRP浓度，单位为pg/mL。