[发明专利]CYP119‑T213G酶及其纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及CYP119-T213G酶及其纯化方法。

背景技术

CYP119酶(cytochrome P450 119)来自黄石公园火山口分离的嗜酸嗜热硫矿硫叶菌(Sulfolobus solfataricus)，因此该酶具耐酸抗高温等作用。CYP119酶能催化月桂酸和苯乙烯等底物发生环氧化反应，该反应绿色环保具有较高应用前景。目前文献报道CYP119酶在过氧化氢或假单孢氧还蛋白-还原酶(Pd/PdR)和辅酶NADPH条件下能催化月桂酸羟基化和苯乙烯环氧化的反应。在常温下CYP119酶催化苯乙烯环氧化反应的过氧化氢酶途径中，催化常数为Kcat＝0.6min^-1(Laura S.Koo et al.2000)。R和S构型的环氧苯乙烷之比约为1:3。后来Rabe KS等，考察了CYP119酶催化苯乙烯环氧化反应的最佳温度和pH值，结果表明，温度为70℃，叔丁基过氧化氢(TBHP)为辅助氧化剂，pH8.5的甘氨酸缓冲液为野生型CYP119酶催化苯乙烯环氧化反应的最佳反应条件。通过动力学研究得到了其k_cat＝78.2±20.6min^-1，K_m＝9.2±4.3Mm，比常温下提高了100多倍，但是随着温度的升高，其对应选择性降低。为改善酶的催化效率，Laura S.Koo(2000)小组将野生型酶进行突变，发现突变体T214V能明显改善与苯乙烯的结合能力，过氧化氢途径下的苯乙烯环氧化反应速率比野生型提高了近3倍，对应选择性未发生改变。该小组发现213位是该酶的活性中心，而214位在电子传递中起到关键作用(Laura S.K et al.2002)。在213位进行了A、V、S、F、W几种氨基酸的突变，仅T213A的催化效率接近野生型酶，其它几种突变体催化效率明显降低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种催化效率更高的CYP119酶。

本发明的技术方案是一种CYP119-T213G酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步的，编码CYP119-T213G酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了表达CYP119-T213G酶的载体。

进一步的，所述的载体为质粒。

本发明还提供了包含所述载体的宿主。

进一步的，所述的宿主为大肠杆菌。

本发明还提供了CYP119-T213G酶的纯化方法，包括如下步骤：

a、取发酵后的菌液离心收集菌体，PBS悬浮菌体，破碎细胞，离心，收集上清液，获得粗酶液；

b、0.22μm过滤膜过滤粗酶液，利用Ni-NTA柱进行纯化，收集洗脱液；

c、对洗脱液用超滤膜浓缩，再用50mM pH7.4的PBS置换洗脱液3次，浓缩至酶液呈现鲜红色或红黑色，得到纯品。

具体的，步骤b中的洗脱条件为：平衡液I洗脱5个柱体积；将0.22μm过滤膜过滤后的粗酶液上柱；平衡液I洗5个柱体积；平衡液II洗5个柱体积；洗脱液I洗6个柱体积；洗脱液II洗5个柱体积，收集洗脱液；平衡液I为50mM PBS，pH7.4，5mM咪唑；平衡液II为50mM PBS，0.5M NaCl，pH7.4，5mM咪唑；洗脱液I为50mM PBS，pH7.4，20mM咪唑；洗脱液II为50mM PBS，pH7.4，80mM咪唑。

本发明提供了一种催化效率更高的CYP119酶，是在213位将苏氨酸突变为甘氨酸得到的突变体。在常温下，CYP119-T213G酶催化苯乙烯环氧化反应的催化能力提高了近80倍，且对应选择性也比野生型酶高，R/S＝1:5，具有出人意料的技术效果。以上结果说明突变后的CYP119-T213G酶能提高酶对苯乙烯的环氧化反应，且具有较高的对应选择性，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1CYP119-T213G催化苯乙烯环氧化反应米氏方程

具体实施方式

实施例1CYP119-T213G酶表达载体构建