[发明专利]用于鉴定金钱豹的多重PCR引物和方法以及它们在鉴定金钱豹中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体地，涉及一种用于鉴定金钱豹的多重PCR引物及使用所述多重PCR引物鉴定金钱豹的方法，以及它们在鉴定金钱豹中的应用。

背景技术

基于分类学的准确物种鉴定是人类认知自然和可持续发展的必要前提。它为生物多样性的保护、物种资源的可持续性利用，以及生物来源的新产品开发等提供了知识和理论基础。对于物种的鉴定，传统的方法主要是采用形态学证据来进行。但该方法的一些缺陷也造成了濒危动物保护工作的局限，例如表型可塑性和遗传可变性、无法区分隐存分类单元、受生物性别和发育阶段限制等。在野生动物保护的实践工作中，一些来源不明的送检动物样品往往是不完整且样品量较小，已很难从形态学上加以识别，如毛发、残肢、腐败组织、骨骼、皮张及粪便等。但是，根据《中华人民共和国野生动物保护法》的规定，准确的物种信息是量刑的重要法律证据，直接涉及到犯罪嫌疑人的切身权力和行政部门的严格执法问题。

金钱豹(Panthera pardus)是哺乳纲(Mammalia)食肉目(Carnivora)猫科(Felidae)豹属(Panthera)的一种大型猫科动物。肩高约0.9米，体长约1米，体重50～90千克，仅尾长就有约0.6米。金钱豹的颜色鲜艳，有许多斑点和金黄色的毛皮，故又名豹或花豹。金钱豹在国外主要分布于印度半岛、西亚、中亚、东南亚、东亚、北亚、斯里兰卡岛、阿拉伯半岛及全非洲。在国内，金钱豹有3个亚种的分布：华南豹(P.pardus fusea)、华北豹(P.pardusfontanieri)和远东豹(P.pardus orientalis)。在我国华东地区分布的金钱豹物种皆属华南亚种。

金钱豹作为食物网中的顶级食肉动物，捕食多种动物，在营养级序列中占据着多个级别，也是维持生态系统功能和生物多样性水平的关键物种。与世界其它的猫科动物一样，金钱豹同样受到分布密度低、活动范围大、猎物数量下降、偷猎等因素的广泛威胁。在中国，金钱豹已被列为国家一级重点保护野生动物。在全世界，也被列入世界自然保护联盟(IUCN)近危(NT)级物种，同时还被《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)列入附录I物种，金钱豹及其物种产品被严格禁止国际商业贸易。因此，在实际的野生动物保护工作中，对金钱豹及其相关制品进行科学、准确地物种鉴定是开展各项执法工作的前提。

另一方面，由于受到活动隐匿、难以捕获等原因的限制，目前开展有关大型猫科动物的种群生态学研究只能依赖于间接的证据，例如痕迹证据(如足迹、擦痕、尿迹及抓痕等)和对当地居民的走访调查等。但痕迹仅能对野生金钱豹种群提供定性的数据，并不能实现跟踪并监测野外种群的数量动态波动。近年来，以动物粪便为研究材料的粪便DNA分析技术极大地扩展了非损伤性取样的范围，丰富了保护遗传学的研究技术。通过对粪便DNA中多种遗传标记的识别，研究者可以对野生动物的种群数量调查、领域边界划定、生活史、种群遗传结构和遗传多样性等方面进行深入的研究。在开展基于粪便DNA的兽类种群生态学研究中，往往需要研究者首先对采自野外的大量兽类粪便样品根据粪型特点进行初步的判别，将金钱豹物种的粪便单独挑选出来备用，这是一项非常耗费时间的前期准备工作。同时，由于粪型等形态学特征往往在野外及送回实验室的运输过程中容易受到破坏，给大量粪便样品的识别和鉴定带来困难。如果依靠分子测序方法进行鉴定，则会造成花费增大的经济问题。此外，已有大量研究表明，较小扩增产物长度(一般 <500bp)可有效地提高针对粪便DNA的PCR特异性和成功率。这要求我们开发的特异引物扩增产物还必须具有片度不能太大的特点。

近年来DNA分类鉴定技术的飞速发展为物种的保护、野生动物的有效管理提供了强大的工具。动物线粒体DNA(mtDNA)的Cyt b基因和12S rRNA基因中同时存在较快和较慢进化的密码子位点，以及保守区域和突变区域的存在使得其可应用于动物系统学研究。目前被广大学者认为是开展动物种上和种下阶元间系统进化研究最好的分子遗传标记之一。

因此，提供一种无需DNA的测序、序列比对等繁琐步骤，同时对样品来源无限制，且可仅通过一次PCR扩增即可快速有效地实现对金钱豹物种的精确测定的多重PCR引物是本发明亟需解决的问题。

发明内容