[发明专利]一种IgA1酶及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶，特别是IgA1酶及其制备方法，以及其在制备治疗IgA肾病的药物中的应用。

背景技术

IgA肾病(IgAN)是全球范围内最为常见的原发性肾小球疾病，大约25％～50％的患者在疾病诊断后25年内发展到终末期肾衰竭(ESRD)；患者即使接受肾移植，仍有超过50％的患者在肾移植术后两年内IgAN复发。因此，对IgAN的发病机制及其防治研究具有重要的临床价值和社会意义。

现有研究表明，IgAN作为一种自身免疫性疾病，是以IgA或以IgA为主的免疫球蛋白在肾小球系膜区及毛细血管袢呈弥漫颗粒状或团块状沉积所引起一系列临床及病理改变。半乳糖缺失的IgA暴露其铰链区抗原决定簇，使得针对异常IgA的自身IgG和IgA抗体产生，形成的免疫复合物沉积于系膜区，激活系膜细胞及补体系统导致肾脏损伤。

目前，在原治疗基础上从自身免疫发病机制角度出发，探索新的IgAN治疗思路成为了研究热点。现有研究发现(IgA1蛋白酶的生物学作用，生物医学工程学杂志，2011年4月第28卷第2期，张紫媛等，P423-427)，一些微生物因其产生IgA酶对人类有致病性，但是由于IgA酶能够降解IgA分子，使得研究人员希望使用IgA酶来对IgAN进行治疗。不过，由于缺乏可靠的动物模型，这个领域的研究主要集中在体外实验上，IgA酶是否能够有潜在的治疗用途还不能客观的评价。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的一个方面是提供一种制备IgA1酶的制备方法，它包括以下步骤：

1)以细菌作为发酵菌株，发酵完成后，得到发酵液；所述的细菌为淋球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎球菌或变异链球菌；

2)分离纯化发酵液，得IgA1酶。

优选的，所述的细菌为淋球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎球菌。

进一步优选的，所述淋球菌为菌株号为ATCC49226的菌株；所述流感嗜血杆菌为菌株号为ATCC49247或ATCC10211的菌株；所述肺炎链球菌为菌株号为6303^TM(血清3型)的菌株；脑膜炎球菌为菌株号为ATCC13090的菌株。

更优选的细菌为淋球菌，其菌株号为ATCC49226；或者为流感嗜血杆菌，其菌株号为ATCC49247。

最优选的细菌为流感嗜血杆菌，其菌株号为ATCC49247。

本发明所述制备IgA1酶的方法中，步骤1)中所述的发酵方法是：

将细菌复苏后接种于液体培养基中，置37℃200r/min震荡培养18h，使菌悬液的光吸收值A600为1.0；

将菌悬液以体积比10％的比例接种于液体培养基中，37℃200r/min震荡培养15-24h后，离心，收集上清液备用；

步骤2)中所述的分离纯化方法是：

取步骤1)得到的上清液，在4℃搅拌条件下加入饱和硫酸铵(NH₄)₂SO₄至终浓度为50％，之后静置2h，于4℃离心，收集沉淀，用Tris-HCl缓冲液溶解，即获得IgA蛋白酶粗制品，透析、浓缩后即得。

本发明的另一个目的是提供一种IgA1酶，其最适作用温度为35-45℃；最适作用PH值为6-10；其底物为正常糖基化或异常糖基化的IgA1；PMSF和SDS可完全抑制IgA1酶活性，DTT和EDTA则无影响；Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺和Fe²⁺均可抑制IgA1酶的活性，Ca²⁺和Mg²⁺对酶活性影响不明显，而Co²⁺、Mn²⁺和Al³⁺对不同菌种分泌的酶活性影响存在差异性；IgA1酶对底物IgA1的分解作用不受其低糖基化程度的影响。

并且它是由权利要求1～6任意一项所述的方法制备的。

本发明的再一方面是提供所述的IgA1酶在制备治疗IgAN的药物中的用途。

在一个具体的实施例中，本发明制备了稳定的动物模型，制备方法简单，能够用于评价本发明的IgA1酶对沉积于肾组织中的免疫复合物的消化能力。

在一个具体的实施例中，采用商品化的IgA1酶和从流感嗜血杆菌ATCC49247中提取的IgA1酶注射到动物模型中，评价不同的IgA1酶对体内IgA1的消化能力。