[发明专利]杂色曲霉SD-3及其在制备甲壳素脱乙酰酶中的应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种产甲壳素脱乙酰酶的杂色曲霉(Aspergillus versicolor)SD-3及其制备甲壳素脱乙酰酶中的应用。

(二)背景技术

甲壳素，又称几丁质(chitin)，是由N-乙酰氨基-D-葡萄糖单体通过β-1,4-糖苷键连接而成的多糖，广泛存在于许多无脊椎动物(如虾、蟹、昆虫等)的外壳或角质层，是自然界中仅次于纤维素的天然多糖。甲壳素分子结构因其分子内部的结晶结构和很强的氢键作用，很难溶于稀酸碱及一般的有机溶剂，因此应用范围不广。当甲壳素分子中的乙酰基部分或全部脱除后，则形成壳聚糖(chitosan)，由于具有无毒、可被生物降解、良好的生物相容性和成膜性等优良特性，在医药、食品、化工、化妆品和生物医学工程等诸多领域有着广泛的应用。

甲壳素脱乙酰化生产壳聚糖的方法常见的有化学法和酶法，目前基本都是采用浓碱热解法生产。浓碱法反应过程不易控制，常常会影响到产品的粘度和分子量，且其排放的污水对环境造成严重污染，壳聚糖产品的特性也存在不足，如脱乙酰度不均匀、分子量分布范围宽、乙酰基所在的位置不能固定等，使得产品的实际应用范围有限。相比之下，利用酶解法生产壳聚糖，既可以解决目前壳聚糖生产中的环境污染问题，又可以生产出高质量的壳聚糖产品，如乙酰化程度均匀、分子量分布范围窄，以及具有特定乙酰化位置的壳聚寡糖等，是一条既经济又行之有效的壳聚糖制备方法。

酶法生产壳聚糖需要的酶是甲壳素脱乙酰酶(chitin deacetylase，E.C.3.5.1.41)，它是一种催化甲壳素中N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺的乙酰氨基水解的酶。甲壳素脱乙酰酶来源广泛，包括部分真菌、植物病原体和一些昆虫等，其中以真菌最多，也是获得该酶的最佳来源。虽然目前国内外对甲壳素脱乙酰酶的研究已经相当广泛和深入，甚至已经发展到了分子水平，但仍未见将其工业化生产并应用于壳聚糖生产的报道，工业化应用研究亟待加强。

我国沿海地区虾蟹类加工业发达，现有数十家甲壳素的生产企业，目前对甲壳素的进一步加工利用主要是通过高温强碱脱乙酰生产壳聚糖，以及对壳聚糖进一步高温强酸水解生产壳寡糖和氨基葡萄糖。但是由于生产过程耗能大且产生大量废液，导致产品能耗高，环境污染严重，许多甲壳素加工企业也因污染严重，无力治污而面临关闭。

因此，摒弃污染大的生产工艺，利用绿色环保的酶解法来生产壳聚糖，是甲壳素生产企业的必行之道。酶解法生产壳聚糖工艺过程并不复杂，但关键是要有酶活力高、活性稳定、价格低的甲壳素脱乙酰酶作保证。国内外有不少报道关于采用微生物制备甲壳素脱乙酰酶，但仍然存在微生物发酵周期长、酶活力低或发酵成本高等问题，至今未见产业化生产甲壳素脱乙酰酶的报道。即使有报道采用基因工程方法将甲壳素脱乙酰酶基因转入大肠杆菌中表达，也未能产业化应用。因此，获得产酶活力高、生长繁殖快、营养要求低的产甲壳素脱乙酰酶微生物菌株，以及发酵工艺简单、原料成本低等仍是该酶工业化应用的关键。

(三)发明内容

本发明目的是提供一株甲壳素脱乙酰酶产生菌——杂色曲霉(Aspergillus versicolor)SD-3，及其在制备甲壳素脱乙酰酶中的应用，较好地克服现有微生物发酵生产甲壳素脱乙酰酶的培养基成本高、发酵周期长和酶活性低的缺点，生产工艺具有成本低、工艺简单、效率高等优点。

本发明采用的技术方案是：

本发明涉及一株甲壳素脱乙酰酶产生菌—杂色曲霉(Aspergillus versicolor)SD-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC NO：M 2013328；保藏日期：2013年7月11日。

本发明所述杂色曲霉SD-3，是由甲壳素混入土壤经过自然富集和人工富集培养，从富集培养物中分离和筛选得到的优良野生菌株，再经紫外线照射诱变处理和筛选获得。

所述杂色曲霉SD-3的形态学特征如下：涂布或划线接种于马铃薯平板培养基上，生长迅速，28℃下培养3～4天菌丝便长满平板，并产生大量分生孢子。菌落呈絮状，正面灰绿色，反面黄褐色。分生孢子穗疏松放射状，顶囊近球形或梨形；分生孢子梗双层，无色，表面光滑；分生孢子球形或近球形，褐色，表面粗糙。

所述杂色曲霉SD-3的18s rDNA的部分核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：