[发明专利]短链寡核苷酸甲醇固定花青素染色法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学核酸非放射性同位素染色方法领域，具体是在电泳后采用甲醇固定，再用SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye 和SYBR Green II RNA gel stain两种花青素类核酸染料中的一种进行染色，对长度为5-11个碱基的寡核苷酸进行检测的方法。

背景技术

寡核苷酸主要是指20个以下碱基的短链核苷酸，包括脱氧寡核糖核酸(DNA)及寡核糖核酸(RNA)，在自然界中广泛存在，也可以是人工合成的产物，人工合成的寡核苷酸主要用于PCR、核酸分子杂交、核酸连接反应和RNA干扰等过程。寡核苷酸质量的好坏可直接影响上述过程的成败，因此在上述试验中常常需要检测寡核苷酸的长度和质量。目前检测寡核苷酸长度和质量的简便有效的方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳。

寡核苷酸经过聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，必须用放射性同位素标记或非放射性同位素染色才能显现出来。由于放射性同位素标记可以进行原位放射自显影，短链寡核苷酸扩散丢失较少，因此放射性同位素标记的优点是受检寡核苷酸的最小长度不受限制，其缺点是可对操作人员造成损伤，对环境造成污染，放射废物不易处理等，现已几乎被非放射性同位素染色所取代。

目前寡核苷酸的非同位素染色方法主要有溴乙锭(EB)染色、不对称花青素类染色(包括SYBR Green I、SYBR Green II和SYBR Gold等)和银染色等。EB染色的最大优点是价格便宜，操作简单，但EB是一种强致癌物质，易对环境造成污染或对操作人员造成损害，且灵敏度不够高。不对称花青素的灵敏度比EB高，背景低，无需洗脱过程，未发现有致癌性，在凝胶中检测DNA和RNA的灵敏度比EB高出10倍以上，可用于检测双链和单链DNA以及RNA等，其主要缺点是成本较高，不够稳定，易受pH值等因素的影响。银染法的优点主要是敏感度高，可接近甚至达到放射性同位素的水平，是目前检测寡核苷酸比较常用的染色方法之一。

以上介绍的核酸染色方法对于15个碱基以上的长链寡核苷酸的检测都比较有效。但除了银染法之外，上述其它染色方法都不能有效检测短链寡核苷酸，这是因为寡核苷酸片段较短，尤其是当其长度只有11及11个碱基以下时，寡核苷酸在染色的过程中容易从凝胶中扩散出来，从而造成染色失败。但采用银染法又有操作步骤较多，耗时较长，不能检出某些寡核苷酸的缺点。

发明内容

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种比银染法更简便的短链寡核苷酸非放射性同位素染色方法，用于检测5-11个碱基长度的短链寡核苷酸。

本发明采用的技术方案如下：首先对寡核苷酸进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后用甲醇固定液将寡核苷酸固定在聚丙烯酰胺凝胶上，防止或尽量减少其扩散，然后用去离子水进行漂洗，再用SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye和SYBR Green II RNA gel stain两种花青素类染料中的一种染料进行染色，最后用紫外透视仪或凝胶成像仪观察结果。其中SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye主要用于双链DNA染色，而SYBR Green II RNA gel stain则主要用于RNA及单链DNA染色。

进一步地，上述对寡核苷酸进行聚丙烯酰胺凝胶电泳的具体步骤为：

(1)准备样品

将寡核苷酸配制成100μM的溶液，然后在微量紫外分光光度计上测定其实际浓度；配制甲酰胺加样缓冲液，其配方为：960μl甲酰胺，40μl 250mmol/L、EDTA(pH8.0),0.05％(w/v)溴酚蓝；

(2)制作浓度为15-45％(w/v)的变性聚丙烯酰胺凝胶：凝胶中丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺之重量比为19/1，尿素的浓度为4-7M，凝胶的大小为10×10cm，厚度为0.3mm。凝胶和电泳槽缓冲液分别为1XTBE和0.5XTBE。

优选地，5-10个碱基的寡核苷酸选用30-45％(w/v)的凝胶，10-15个碱基的寡核苷酸选用20-30％(w/v)的凝胶，15个碱基以上(含15个)的寡核苷酸选用15-25％(w/v)的凝胶。

优选地，15-35％(w/v)凝胶中的尿素浓度为7M，40％(w/v)凝胶中的尿素浓度为6M，45％(w/v)的凝胶中的尿素浓度为4M。

(3)变性处理：将1μg的寡核苷酸与2μl加样缓冲液混匀，于95℃变性30-60秒，迅速插入碎冰中，以破坏寡核苷酸的二级结构；