[发明专利]基于AAV‑ITR的基因表达微载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种基于AAV-ITR的基因表达微载体在宿主细胞内高效稳定表达外源基因的方法，其特征在于：

其中所述基于AAV-ITR的基因表达微载体包括用于表达外源基因的基因表达框，其中，所述基因表达框两端分别连接有AAV基因组的ITR序列，所述基因表达框为线性表达框，并且所述基因表达框包含在两段AAV基因组的ITR序列之间依次分布的CMV增强子、Chickenβ-actin启动子、多克隆位点和SV40-Ploy(A)，所述AAV基因组的ITR序列中不包含D序列；

其步骤如下：

(1)提供AAV-ITR表达框，并克隆在pUC57质粒的多克隆位点，获得含有基因表达微载体序列的质粒pUC57-minivector，其中，所述基因表达微载体包括两组AAV基因组的ITR序列，该两组ITR序列之间分布有用于表达外源基因的基因表达框；

(2)将EGFP序列克隆至载体质粒pUC57-minivector，获得微载体扩增质粒pUC57-minivector-EGFP，再以pUC57-minivector-EGFP为模板，PCR扩增该两组ITR序列中的两组D序列之间的DNA片段，该PCR扩增采用的上游引物序列为5’-GCGTCTAGAGGTACCCTAGTTATTATTAGTAATC，下游引物序列为5’-GCG TCTAGATAA AAAACCTCCCACACCTCCC，通过XbaI酶切微载体扩增质粒pUC57-minivector-EGFP，并将其与PCR扩增得到的左、右D序列之间的片段连接获得微载体扩增质粒pUC57-minivector-ΔD–EGFP；

(3)NotI酶切微载体扩增质粒pUC57-minivector-ΔD–EGFP，并回收目的片段，而后依次进行热变性和冷却处理，获得不含D序列的所述基因表达微载体；

(4)在体外细胞中表达不含D序列的AAV-ITR的基因表达微载体。