[发明专利]基于AAV‑ITR的基因表达微载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因表达微载体，特别涉及一种新型的、基于腺相关病毒（AAV）倒置末端重复序列（ITR）的基因表达微载体（AAV-ITR Mini Vector）以及该基因表达微载体的构建方法和应用。

背景技术

基因治疗(gene therapy)是指通过基因工程技术将外源正常基因导入靶细胞，替代异常基因、封闭或祛除致病基因、修复受损基因或重建调控系统等，以纠正或补偿由于基因缺陷和异常所引起的疾病，从而到达治疗疾病的目的。基因治疗已被广泛用于治疗遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等，到2013年2月底为止，世界上已有1902种基因治疗药物进入临床试验中。基因治疗的关键技术是选用合适的载体将外源基因有效导入受体靶细胞，并有效地进行外源基因表达。而基因治疗的难点是载体的转染、表达效率低以及存在安全隐患，因此研发能够稳定转染并且安全有效的基因治疗载体是现今基因治疗研究领域的重点。传统的基因治疗表达载体有病毒表达载体及质粒表达载体。尽管病毒载体具有转染效率高、靶向性强的优点，但其潜在的致癌性、致毒风险、自身免疫原性和造成细胞病理改变等缺点在一定程度上限制了其在基因治疗中的广泛应用。质粒载体中含有细菌复制序列、抗性基因、未甲基化的CpG序列和一些可能隐藏的表达信号，这些序列在质粒复制时是必需的，但在基因治疗过程中可能引发严重的安全性问题。所以研究开发具有稳定性、安全性和靶向性的非病毒载体日益受到重视。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种基于AAV-ITR的基因表达微载体，其在应用时能够实现外源基因在宿主细胞内的高效、稳定、安全的表达，从而克服了现有技术中的不足。

本发明的目的之二在于提供一种构建前述基于AAV-ITR的基因表达微载体的方法。

本发明的目的之三在于提供前述基于AAV-ITR的基因表达微载体在表达外源基因中的应用。

为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

一种基于AAV-ITR的基因表达微载体，包括用于表达外源基因的基因表达框，所述基因表达框两端分别连接有AAV基因组的ITR序列。

进一步的，所述基因表达框包括线性表达框。

作为较为优选的实施方案之一，所述基因表达框包含在两段AAV基因组的ITR序列之间依次分布的CMV 增强子、Chicken β-actin 启动子、多克隆位点和SV40-Ploy(A)。

作为较为优选的实施方案之一，所述AAV基因组的ITR序列中不包含D序列。

一种基因表达载体质粒，其特征在于，包括如上任一项所述的基因表达微载体。

如上任一项所述基因表达微载体和所述基因表达载体质粒在宿主细胞内稳定表达外源基因的用途。

一种基于AAV-ITR的基因表达微载体的构建方法，包括：

（1）提供AAV-ITR表达框，并克隆在pUC57质粒的多克隆位点，获得含有所述基因表达微载体序列的质粒pUC57-minivector，其中，所述基因表达微载体包括两组AAV基因组的ITR序列，该两组ITR序列之间分布有用于表达外源基因的基因表达框；

（2）将EGFP序列克隆至载体质粒pUC57-minivector，获得微载体扩增质粒pUC57-minivector-EGFP；

（3）NotI 酶切微载体扩增质粒pUC57-minivector-EGFP，并回收目的片段ds-minivector-EGFP，而后依次进行热变性和冷却处理，获得所述基因表达微载体。

作为较为优选的实施方案之一，该方法还可包括：

（2X）以pUC57-minivector-EGFP为模板，PCR扩增该两组ITR序列中的两组D序列之间的DNA片段，获得微载体扩增质粒pUC57-minivector-ΔD –EGFP；以及，

（3X）参照步骤（3）的操作处理微载体扩增质粒pUC57-minivector-ΔD –EGFP，获得不含D序列的所述基因表达微载体。

具体的，该方法包括：

（1）提供AAV-ITR表达框，并克隆在pUC57质粒的多克隆位点，获得含有所述基因表达微载体序列的质粒pUC57-minivector；

（2）以含有EGFP的质粒pds-AAV-CB-EGFP为模板，通过PCR扩增得到EGFP序列，再将EGFP序列克隆至载体质粒pUC57-minivector，获得微载体扩增质粒pUC57-minivector-EGFP；