[发明专利]单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种单细胞的转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

从单细胞中制备cDNA样品；

对所述cDNA样品进行片段化文库构建，得到所述单细胞的转录组测序文库；

其中，所述片段化文库构建步骤中采用物理破碎的方式对所述cDNA样品进行片段化，且对片段化的产物无需进行纯化的步骤。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，对所述cDNA样品进行片段化文库构建的步骤包括：

步骤S1，对所述cDNA样品采用物理破碎的方式进行片段化，得到片段化样品；

步骤S2，对所述片段化样品不经过纯化直接进行末端修复，同时添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，得到修复后样品；

步骤S3，对所述修复后样品进行接头连接，得到带接头样品；

步骤S4，对所述带接头样品进行扩增，得到所述单细胞的转录组测序文库。

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述物理破碎的方式为采用自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对所述cDNA样品进行片段化；优选所述自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对所述cDNA样品进行片段化时的参数设置为：循环数8％～12％，峰值入射功率170～180瓦；循环数/爆发200～220个；时间300～360s；温度4～8℃。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对所述cDNA样品进行片段化后得到的所述片段化样品的长度为150～200bp。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在得到所述片段化样品之后，以及对所述片段化样品进行所述末端修复的步骤之前，还包括对所述片段化样品进行浓缩的步骤；优选采用Thermo Scientific公司的Thermo Scientific DNA Speed111V离心浓缩系统。

6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，

在所述步骤S2中采用NEB公司的末端修复酶试剂组合对所述片段化样品不经纯化直接进行末端修复，同时添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所述末端修复酶试剂组合包括10×的NEBNext末端修复反应缓冲液和NEBNext末端制备酶混合物；

在所述步骤S3中采用NEB公司的平末端/粘性TA末端连接酶混合物和NEBNext接头对所述修复后样品进行接头连接；

在所述步骤S4中采用KAPA BIO公司的2×的KaPA HiFi反应混合物对所述接头样品进行扩增。

7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，当所述片段化样品的量低至3ng时，在所述步骤S3中，对所述接头进行稀释后再进行接头连接；优选将所述接头稀释至1.0～2.0μM；更优选稀释至1.5μM。

8.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S4中，所述扩增采用其中一条上带有标签序列的扩增引物进行扩增，优选所述标签序列为所述扩增引物上的一段6～10个按特定顺序排列的碱基序列；更优选所述扩增引物的序列为带有标签序列的SEQ ID NO.1：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT CTTCCGATCT-3’和不带有标签序列的SEQ ID NO.2：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT CT-3’。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S4中，所述扩增的循环次数为10～15次，优选13次。

10.权利要求1至9中任一项所述的构建方法在研究细胞异质性方面的应用。