[发明专利]单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及高通量测序技术领域，具体而言，涉及一种单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用。

背景技术

随着现代生物学的发展，细胞群体的研究已不再能满足科研的需求，单细胞研究不仅能解决组织细胞所不能解决的细胞异质性问题，而且还为解析单细胞的行为、机制以及与机体的关系提供了新的研究方向。目前，将高通量测序运用于单细胞研究的单细胞测序成为时下单细胞研究的一种新途径，主要包括单细胞全基因组测序及单细胞转录组测序。

对于单细胞转录组测序来说，转录组测序文库的构建是主要的难点，因为单细胞中mRNA含量低至10pg，无法通过常规的RNA转录组文库的构建方法来构建。因此，目前市场上能够利用如此少量的mRNA进行单细胞转录组测序文库构建的产品只有Illumina公司的DNA文库构建试剂盒(illumina Nextera XT DNA sample preparation kit)。

Illumina公司的该试剂盒是采用化学方法对样品进行片段化，即用转座酶对cDNA进行打断的方式建库。其具体流程图1所示，单细胞经裂解后，mRNA经反转录得到cDNA，然后对cDNA进行预扩增后，采用转座酶打断的方式对cDNA进行片段化处理。于此同时，转座酶在打断后同时会在破碎片段的两端加上接头，然后再经PCR对片段进行富集，该步骤中PCR的引物会在破碎片段的两端带上标签序列(index)，加标签序列的目的是给不同的样品带上不同的标签，以便从得到的混合测序数据中分离出各样品所对应的测序数据。

Illumina公司的上述DNA文库构建试剂盒具有能从低至1ng的样品起始量进行文库构建的巨大优势，但也存在文库上机定量的不准，数据量产出不稳定的问题。因为如果是数据产出过量，浪费成本；如果产量不足，还需要后期额外加测，耽误项目周期。

因此，仍需要对现有的单细胞转录组测序文库构建方法进行改进，以使所构建的转录组测序文库能够满足数据量产出稳定的要求。

发明内容

本发明旨在提供一种单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用，以提高文库的数据量的产出稳定性。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种单细胞的转录组测序文库的构建方法，该构建方法包括以下步骤：从单细胞中制备cDNA样品；对cDNA样品进行片段化文库构建，得到单细胞的转录组测序文库；其中，片段化文库构建步骤中采用物理破碎的方式对cDNA样品进行片段化，且对片段化的产物无需进行纯化的步骤。

进一步地，上述对cDNA样品进行片段化文库构建的步骤包括：步骤S1，对cDNA样品采用物理破碎的方式进行片段化，得到片段化样品；步骤S2，对片段化样品不经过纯化直接进行末端修复，同时添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，得到修复后样品；步骤S3，对修复后样品进行接头连接，得到带接头样品；步骤S4，对带接头样品进行扩增，得到单细胞的转录组测序文库。

进一步地，上述物理破碎的方式为采用自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对cDNA样品进行片段化；优选自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对cDNA样品进行片段化时的参数设置为：循环数8％～12％，峰值入射功率170～180瓦；循环数/爆发200～220个；时间300～360s；温度4～8℃。

进一步地，自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对cDNA样品进行片段化后得到的片段化样品的长度为150～200bp。

进一步地，在得到片段化样品之后，以及对片段化样品进行末端修复的步骤之前，还包括对片段化样品进行浓缩的步骤；优选采用Thermo Scientific公司的Thermo Scientific DNA Speed111V离心浓缩系统。

进一步地，在所述步骤S2中采用NEB公司的末端修复酶试剂组合对所述片段化样品不经纯化直接进行末端修复，同时添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所述末端修复酶试剂组合包括10×的NEBNext末端修复反应缓冲液和NEBNext末端制备酶混合物；在所述步骤S3中采用NEB公司的平末端/粘性TA末端连接酶混合物和NEBNext接头对所述修复后样品进行接头连接；在所述步骤S4中采用KAPA BIO公司的2×的KaPA HiFi反应混合物对所述接头样品进行扩增。

进一步地，当片段化样品的量低至3ng时，在步骤S3中，对接头进行稀释后再进行接头连接；优选将接头稀释至1.0～2.0μM；更优选稀释至1.5μM。