[发明专利]冬虫夏草中国被毛孢苹果酸脱氢酶A、编码基因及其应用

权利要求书

1.一种冬虫夏草中国被毛孢苹果酸脱氢酶A，其特征在于所述脱氢酶A的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的苹果酸脱氢酶A在生物催化苹果酸制备草酰乙酸中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含苹果酸脱氢酶A基因的重组工程菌经诱导培养获得的湿菌体用pH8.0磷酸盐缓冲液悬浮，超声破碎后，离心，取上清液为催化剂，以0.1M苹果酸水溶液为底物，以3.75mM的NADH水溶液为辅酶，于pH值为7.0的磷酸缓冲液中，37℃下反应，反应结束后，将反应液离心，取上清液即获得含草酰乙酸的混合液。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述底物的体积用量以苹果酸质量计，所述苹果酸的初始浓度为0.05M，所述催化剂的体积用量以破碎前湿菌体的质量计为4.2g/L，所述反应体系中NADH的用量为3.75μmol/L。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含苹果酸脱氢酶A基因的重组工程菌接种于含终浓度50μg/ml的Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养过夜，取培养物，以体积浓度2％接种量转接于含有终浓度50μg/ml Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养至菌体浓度OD600为0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.05mmol/L的IPTG诱导培养8h，收集湿菌体，将湿菌体在功率40％、破1s停1s条件下超声破碎，离心，取上清液即为催化剂。

6.一种编码权利要求1所述苹果酸脱氢酶A的基因。

7.如权利要求6所述的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

8.如权利要求6或7所述的编码基因在构建能够生物催化苹果酸制备草酰乙酸的基因工程菌中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的应用为：构建含有所述苹果酸脱氢酶A基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有苹果酸脱氢酶A基因的菌体细胞。