[发明专利]冬虫夏草中国被毛孢苹果酸脱氢酶A、编码基因及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一个来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与三羧酸循环用于柠檬酸合成中的苹果酸脱氢酶A(Malic dehydrogenase)，编码这个酶的基因及其应用。

(二)背景技术

冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鳞翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(Hepialus armoricanus Oberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括子座和虫体)。冬虫夏草是一类珍惜的传统真菌药材资源，具有代谢产物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。冬虫夏草以其多种药用功效广泛、明显而备受关注，在世界范围内备受推崇。中医认为，冬虫夏草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。

冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无性型确证、活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。冬虫夏草中国被毛孢已被证明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效。

但是，对冬虫夏草中国被毛孢中苹果酸脱氢酶的研究几乎为空白，尤其在参与三羧酸循环用于柠檬酸合成中的苹果酸脱氢酶的研究上。

苹果酸脱氢酶(EC:1.1.1.37)是催化L-苹果酸脱氢变成草酰乙酸的酶。它以NAD⁺作为电子受体。广义上也包括以NAD⁺或NADP⁺作为受体而生成丙酮酸和碳酸的苹果酸酶(EC:1.1.1.38-40)。与NADP⁺也有弱反应，也可将其它羟酸脱氢。广泛存在于线粒体、细菌细胞膜上，为三羧酸循环中的一种酶。由于酶的来源不同，其某些性质也不一样。苹果酸在苹果酸脱氢酶催化下脱氢生成草酰乙酸，脱下的氢由NAD⁺接受生成NADH⁺H⁺。再生的草酰乙酸可再次进入三羧酸循环用于柠檬酸的合成。

苹果酸脱氢酶普遍存在于动物，植物，细菌各种生物体中，具有高度的保守性。苹果酸脱氢酶不仅参与众多生理活动，包括C4循环，呼吸作用，脂肪酸的氧化，TCA循环等，而且在种子萌发，植物生长，花粉发育，果实发育，植物抗逆等方面发挥重要作用。

1993年，F Cendrin等人从极端嗜盐古细菌Haloarcula marismortui中分离和测序了一个编码的酶苹果酸脱氢酶(MDH)的基因。该酶是由303个氨基酸组成，其分子量为32638道尔顿。

2008年，朱文漓等人以实验室构建的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道cDNA文库苹果酸脱氢酶(cMDH)EST序列为基础，采用末端快速扩增法(RACE)，从健康雌性草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道细胞RNA中获得1391bp的草鱼肠道cMDH的cDNA序列(NCBI登录号：EU569765)。结果显示：该序列包含62bp的5'非编码区(5'-UTR)，330bp的3'非编码区(3'-UTR)，典犁加尾信号AATAA位于polyA起点上游16bp。开放阅读框ORF长999bp，共编码333个氨基酸，预测蛋白等电点为6.67，大小为36kDa。

2008年，姚玉欣等人从苹果果实中分离了cyMDH的全长cDNA序列，该序列含有一个996bp的开放阅读框(ORF)。序列同源性分析表明Mal-cyMDH与其他物种cyMDH有较高的同源性。原核表达得到一个37kD左右的融合蛋白，酶活测定表明该酶主要催化合成苹果酸。

2011年，李倩等人以大肠杆菌基因组DNA为模板，扩增得到苹果酸脱氢酶(mdh)编码基因mdh，构建了重组菌pET-28a-mdh/BL21并成功表达了苹果酸脱氢酶，大小约36000。选用Ni柱亲和层析法纯化具有活性的苹果酸脱氢酶，纯化后比酶活达到112.5U/mg，纯化倍数达2.62倍，回收率为59％。