[发明专利]一种添加透明质酸酶提高小分子透明质酸发酵产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种发酵过程中添加酶制备小分子透明质酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)，是一种高分子粘性多糖，以其独特的分子结构和理化性质，使其具有良好的保湿性、粘弹性、渗透性和延展性，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，同时无任何免疫原性和毒性，被广泛应用于化妆品、食品和医药等行业领域。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。

近年来研究发现，低分子量的HA(低于1×10⁴)和透明质酸寡糖具有独特的生物学功能。根据文献研究表明，分子量大小对HA的生物活性影响较大，不同分子量范围的HA却表现出截然不同的生理学功能。高分子量的HA(Mr>2×10⁶)由于具有较好的粘弹性、保湿性、抑制炎性反应、润滑等功能，可应用于高端化妆品行业、眼科手术黏弹剂和关节腔内注射治疗。中等分子量的HA(介于1×10⁶-10⁵)具有良好的保湿性、润滑和药物缓释作用，可广泛用于化妆品、滴眼液、皮肤烧伤愈合及术后防粘连。低分子量的HA(低于1×10⁴)和寡聚透明质酸，表现出非常强的生物活性，具有抑制肿瘤扩散、促进创伤愈合、促进骨和血管生成、免疫调节等作用，且易于渗透到真皮中，免疫细胞、细胞因子的激活剂。因此，小分子透明质酸在食品保健、化妆品以及临床医疗领域具有广阔的应用前景。

随着小分子HA和HA寡糖的研究与应用迅速兴起，近些年以来，国内外开始重视HA的降解及其降解产物的制备研究。目前，HA降解的方法主要有物理降解、化学降解、生物降解3大类。物理降解方法主要有加热、机械剪切力、紫外线、超声波、⁶⁰Co照射、γ-射线辐射等因素均可使HA发生降解。但是，物理法制备的HA分子量普遍高于1万以上，产生的分子量范围分布较大，产品稳定性较差。HA的化学降解方法有水解法和氧化降解法，水解法分酸水解(HCl)和碱水解(NaOH)，氧化降解常用的氧化剂为次氯酸钠(NaClO)和过氧化氢(H₂O₂)。尽管使用化学降解方法降解产物的相对分子质量可以通过改变酸碱或氧化剂的加入量和反应时间来控制，降解成本较低，易于大规模生产，但化学降解法引入了化学试剂，反应条件复杂，易给HA性质产生影响和产品的纯化带来困难，且产生大量的工业废水。生物酶法降解是HA在透明质酸酶(HAase)的作用下，糖链上的糖苷键断裂发生降解。酶解法是温和的降解方法，不但可以制备小分子HA，而且利用此方法可制得链长为4～22的寡糖，而且经过凝胶色谱分离后可以制得单一HA寡糖。但是，目前商品化的透明质酸酶(动物组织提起制备)价格昂贵，不适合应用于工业化制备小分子HA。

本发明在兽疫链球菌发酵产HA过程中添加重组水蛭透明质酸酶，实现发酵过程中直接制备获取小分子透明质酸，这一偶联模式不仅解决了兽疫链球菌发酵后期由于HA的积累粘稠度增大的问题，同时对小分子HA的产量也具有明显的提高。该发明操作过程简单，反应条件温和、专一性高、且产品纯度高，易于实现工业化生产制备小分子透明质酸。

发明内容

本发明公开了一种微生物发酵过程中添加酶制备小分子寡聚透明质酸的方法，是向产高分子HA的微生物发酵体系中添加一定浓度的透明质酸酶溶液，发酵过程控制制备得到小分子寡聚透明质酸。

所述高分子HA的分子量高于10⁶Da，优选10⁵-10⁷Da。

所述产高分子HA的微生物为兽疫链球菌、枯草芽孢杆菌或者重组工程菌株，优选兽疫链球菌。

所述透明质酸酶溶液为粗酶液，过滤除菌，其中反应体系中添加酶活单位数(U)与HA发酵罐装液量(ml)比为10¹-10⁵：1，优选10³-10⁴：1；所述HA溶液与酶液的添加体积比为10⁵：10⁴～1，优选10³：10～1。

所述发酵液的pH值控制在6.0-7.0之间，优选pH7.0。

所述发酵过程的温度37℃。

所述发酵时间为14-28h，优选16-24h。

所述发酵过程中添加酶液的时间点为接种后8h内，优选4h。