[发明专利]早期膀胱癌的多靶标检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及早期膀胱癌的多靶标检测方法。 

背景技术

膀胱癌在全球发病率位列第五。在大多数情况下，约75％的患者处于Ta或T1期，即非肌肉浸润性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC),而剩下的25％肿瘤处于肌肉入侵阶段T2-T4癌症(muscle invasive bladder cancer，MIBC)。约60％-70％的NMIBC肿瘤患者的切除后3年内复发^[1-3]。复发病人中大部分会周期性复发而癌症级别不会进一步恶化，但约25％的病人会发展为MIBC。由于高复发率和恶化的风险，早诊断，早治疗，频繁的长期监测对于膀胱癌患者提高生存率十分重要。 

传统的膀胱癌检查是膀胱镜检查和细胞学活检，但膀胱镜检查属于有创检查，费用高且会给患者带来一定痛苦，其结果可能会受操作者主观判断而带来一定的误差；而细胞学活检则存在灵敏度低的缺陷(34％左右)。因此无创检测，高灵敏高特异性是未来膀胱癌检测和监控手段发展的方向。 

膀胱癌无创检测的关键在于寻找高灵敏高特异性生物标记物，目前这也是膀胱癌研究的一大热点，研究报道很多，目前已有部分标记物已在临床上使用，如下表(Cheung et al.BMC Medicine 2013,11:13) 

膀胱癌像所有的癌症一样，是与相关的基因组上的改变相关的。在表观遗传学上的改变比如DNA甲基化和组蛋白修饰等也经常在肿瘤中被观察到。事实上,DNA甲基化已被证明与各种癌症包括膀胱癌的发展有关。DNA甲基化异常可通过影响染色质结构及癌基因和抑癌基因的表达而参与肿瘤形成。因此，这种特定基因的DNA甲基化可以用来作为生物标志物对膀胱癌进行检测和监控。 

甲基化特异性荧光定量PCR(Quantitative Methylation-specific Polymerase Chain Reaction，qMSP)的技术首先由Herman等于1996年描述。它利用DNA经亚硫酸氢钠处理后，甲基化和非甲基化DNA单链序列的差异来设计不同的PCR引物。MSP是目前最敏感的技术，能发现0.1％的甲基化DNA(～50pg)。 

相比现有的在临床上使用的生物标记物，甲基化生物标记物具有高灵敏高特异性的特点。目前国内还没有通过检测甲基化生物标记物来做肿瘤相关专利技术。 

发明内容

本发明的目的在于公开了早期膀胱癌的多靶标检测方法。 

本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 

1、早期膀胱癌的多靶标检测方法，包括下述步骤： 

(1)、提取患者尿液中所含的DNA； 

(2)、对步骤(1)获得的DNA进行亚硫酸氢盐转化处理； 

(3)、通过甲基化特异性荧光定量PCR对EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154这七个标志物基因进行检测，以ALU-C4作为内参基因； 

(4)、以步骤(3)中标志物基因的相对甲基化水平值与其检出限之间的大小判定患者是否为早期膀胱癌，当任何一个标志物基因的相对甲基化水平值高于其检出限，该患者为早期膀胱癌患者。 

2、根据权利要求1所述的早期膀胱癌的多靶标检测方法，其特征在于，步骤(1)中的DNA总量>500纳克，片段大小>10kb。 

3、根据权利要求1所述的早期膀胱癌的多靶标检测方法，其特征在于，步骤(3)中的针对ALU-C4的上游引物序列为SEQ No.1，下游引物序列为SEQ No.2；针对EOMES的上游引物序列为SEQ No.3，下游引物序列为SEQ No.4；针对GDF15的上游引物序列为SEQ No.5，下游引物序列为SEQ No.6；针对NID2的上游引物序列为SEQ No.7，下游引物序列为SEQ No.8；针对PCDH17的上游引物序列为SEQ No.9，下游引物序列为SEQ  No.10；针对POU4F2的上游引物序列为SEQ No.11，下游引物序列为SEQ No.12；针对TCF21的上游引物序列为SEQ No.13，下游引物序列为SEQ No.14；针对ZNF154的上游引物序列为SEQ No.15，下游引物序列为SEQ No.16。