[发明专利]利用猪去分化脂肪细胞诱导分化形成骨骼肌细胞的方法

权利要求书

1.一种利用猪去分化脂肪细胞诱导分化形成骨骼肌细胞的方法，其步骤包括猪去分化脂肪细胞(DFAT)的培养；其特征在于，它还包括以猪DFAT细胞作为干细胞模型，在体外培养条件下经成肌诱导培养基诱导之后向猪骨骼肌细胞方向分化，具体步骤如下所示：

(1)猪脂肪组织的分离：在离体和无菌条件下取1-7日龄仔猪皮下脂肪组织，用含有1％的双抗(抗青霉素-链霉素)、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗干净；

(2)猪成熟脂肪细胞的分离纯化：利用胶原酶分离法对步骤(1)所得的猪脂肪组织在37℃下，用I型胶原酶消化液消化45min-1h30min，离心纯化后收集成熟脂肪细胞，使用差速贴壁法对成熟脂肪细胞进行进一步的纯化；

(3)猪成熟脂肪细胞的“天花板”培养：将步骤(2)所得的猪成熟脂肪细胞接种至12.5cm²的细胞培养瓶中，加满细胞分离培养基后，于37℃、5％CO₂的条件下倒置培养瓶培养7-14d，直至出现成纤维状的DFAT细胞；

(4)猪DFAT细胞的传代培养：将步骤(3)中原代DFAT细胞用0.25％的胰酶消化1-2min，然后以1:2-1:4的传代比率进行传代培养，传代培养所用的培养基为细胞生长培养基，当细胞生长至汇合度为70％-80％时进行传代，2-3d传代一次；

(5)预先将细胞爬片置于12孔细胞板在37℃下用明胶包被1-2h，然后将步骤(4)所得的第3代DFAT细胞以5×10⁴个/cm²接种于上述含细胞爬片的12孔细胞板中，当细胞生长汇合度为70％-80％时，将所述的DFAT细胞转移至含100-400ng/ml的半乳糖凝素-1(Galectin-1)蛋白的低糖DMEM培养基，即成肌诱导培养基上培养18-24d，每隔3-4d更换一次新鲜的成肌诱导培养基；

(6)对成肌诱导后的DFAT细胞进行免疫荧光染色鉴定：将步骤(5)中诱导后的DFAT细胞进行成肌早期蛋白Desmin和成肌晚期蛋白MyHc的免疫荧光染色鉴定，验证、鉴定被诱导的DFAT细胞是否向骨骼肌细胞进行分化；

磷酸盐缓冲液、I型胶原酶消化液、培养基及制备方法如下：

0.1mol/L磷酸盐缓冲液：称取8.0043g NaCl、0.1998g KCl、0.2717g KH₂PO₄、3.5786g Na₂HPO₄·12H₂O溶于去离子水中，调节PH至7.4，用双蒸水定容至1L，121℃高温灭菌30min；

0.1％(w/v)I型胶原酶消化液：100mg I型胶原酶粉末和1g牛血清白蛋白(BSA)粉末溶于100ml低糖DMEM培养基中，混匀后用0.22μm滤器过滤除菌，分装至10ml离心管中-20℃保存备用；

细胞分离培养基：体积浓度为20％的胎牛血清的低糖DMEM培养基；

细胞生长培养基：体积浓度为15％的胎牛血清、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、1％非必需氨基酸、1％双抗(抗青霉素-链霉素)的低糖DMEM培养基；

成肌诱导培养基：含100-400ng/ml的半乳糖凝素-1(Galectin-1)蛋白的低糖DMEM培养基。

2.如权利要求(1)所述的一种利用猪去分化脂肪细胞诱导分化形成骨骼肌细胞的方法，其特征在于，步骤(2)中的脂肪组织的消化时间为1h。

3.如权利要求1所述的一种利用猪去分化脂肪细胞诱导分化形成骨骼肌细胞的方法，其特征在于，步骤(3)中成熟脂肪细胞的倒置培养时间为10d。

4.如权利要求1所述的一种利用猪去分化脂肪细胞诱导分化形成骨骼肌细胞的方法，其特征在于，步骤(4)中DFAT细胞的传代培养的比例为1:3。

5.如权利要求1所述的一种利用猪去分化脂肪细胞诱导分化形成骨骼肌细胞的方法，其特征在于，步骤(5)中DFAT细胞在成肌诱导培养基上的培养时间为21d。

6.如权利要求(1)所述的一种利用猪去分化脂肪细胞诱导分化形成骨骼肌细胞的方法，其特征在于，成肌诱导培养基中的Galectin-1的浓度为200ng/ml。