[发明专利]利用猪去分化脂肪细胞诱导分化形成骨骼肌细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于动物细胞离体培养技术领域，具体涉及一种利用猪去分化脂肪细胞(DFAT)诱导分化形成骨骼肌细胞的方法。 

背景技术

猪肌肉组织是养猪生产过程中重要的生产性状。而形成肌肉组织的骨骼肌细胞是由中胚层的干细胞，经过定型和分化后形成的多核细胞。遗憾的是，在研究干细胞定型和分化为骨骼肌细胞的过程中，目前还未建立猪源的成肌细胞系或干细胞系。来源于成体组织的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,简称MSCs，下同)和卫星细胞，是常用的原代干细胞成肌分化的模型(Dezawa et al2006)。 

然而，来源于肌肉组织的卫星细胞由于体外分离数量小，在经历长期传代培养之后细胞的增殖活性和分化能力均会降低，为研究带来诸多不便；而间充质干细胞(MSCs)在体外具有多向分化潜能，在合适的培养条件下能够分化成为脂肪细胞，骨细胞，软骨细胞和骨骼肌细胞等(Hass et al2011)。MSCs虽然能够通过体外诱导成肌分化，但是成肌分化相对于成脂或成骨分化要困难很多(Gang et al2008)，导致MSCs成肌分化的效率低迄今为止还没有建立标准化的MSCs成肌分化诱导体系(Beier et al2012)。此外，从动物体内分离的MSCs细胞数量小，细胞纯度不高(Matsumoto et al2008)。这些问题，大大增加了猪骨骼肌生长发育和蛋白质合成机制研究的困难。 

成熟脂肪细胞占脂肪组织体积的90％以上，通常被认为处于分化末期、细胞停滞于不再增殖的状态(Weisberg et al2003)。但是近年来研究表明，成熟脂肪细胞在无诱导培养物的条件下进行体外培养时，能够去分化形成成纤维细胞样、具有多向分化潜能的干细胞，这些细胞被称为去分化脂肪细胞(dedifferentiated fat,简称DFAT，下同)(Matsumoto et al2008)。用于去分化的成熟脂肪细胞分布广泛，且细胞量大，取材容易；而且去分化形成的DFAT细胞纯度高，体外增殖活性强，在体外具有成脂、成骨、成软骨和成肌多向分化潜能(Poloni et al2012)。此外，Kazama等(Kazama et al2008)用5-氮胞苷(5-azacytidine,5-Aza)处理小鼠DFAT细胞，能够诱导DFAT细胞成肌分化，确定了DFAT细胞成肌分化的可能。因此DFAT 细胞有望成为良好的干细胞模型用于骨骼肌发育的研究。但是，目前关于猪DFAT细胞的成肌分化诱导尚无任何文献报道。 

与本发明一般相关的专利文献，如申请号为201110404788.9(一种从成体兔的成熟脂肪细胞诱导分化为心肌样细胞的方法)的专利申请，报道了从兔脂肪组织中分离成熟脂肪细胞，利用传统的“天花板”培养法得到兔DFAT细胞，并且再诱导分化形成心肌样细胞。该专利文献所涉及的只是DFAT细胞向心肌样诱导分化的途径和方法。 

与本发明相关的专利申请文献是申请号为201110002340.4(发明名称：一种猪成熟脂肪细胞快速去分化为前体脂肪细胞的培养方法)报道的方法，该文献报道了通过胶原酶消化法从猪脂肪组织中分离出成熟脂肪细胞，通过“天花板”培养法获得猪DFAT细胞，该文献公开了以DFAT细胞作为前体脂肪细胞的方法和路径，只是公开了获得猪DFAT细胞的分离方法，并没有对所得的猪DFAT细胞进行生物学特性和功能研究和验证，也没有提供相关的实验数据来支持所分离的DFAT细胞就是前体脂肪细胞的证据，在该专利公开说明书的实施例中也没有披露对分离的DFAT细胞进行相关的生物学鉴定的信息，特别是并没有对猪DFAT细胞向成肌方向分化做出任何实验支持及结果的描述。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用猪去分化脂肪细胞(DFAT细胞)向骨骼肌细胞分化的方法，本发明通过“天花板”培养法获得具有干细胞特性的猪DFAT细胞，进一步通过对猪DFAT细胞进行成肌方向诱导，使得猪DFAT细胞向骨骼肌细胞方向分化，诱导得到猪DFAT细胞形成骨骼肌细胞。 

实现本发明的技术方案如下所述： 

一种利用猪去分化脂肪细胞诱导分化形成骨骼肌细胞的方法，其步骤包括猪DFAT细胞的获取；其特征在于，它还包括以猪DFAT细胞作为干细胞模型，在体外培养条件下经成肌诱导培养基诱导之后向猪骨骼肌细胞方向分化，具体步骤如下所示： 

(1)猪脂肪组织的分离：在离体和无菌条件下取1-7日龄仔猪皮下脂肪组织，用含有1％的双抗(抗青霉素-链霉素)、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗干净；