[发明专利]能源作物荻抗盐基因MsVP2及其植物表达载体和构建方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及荻耐盐基因MsVP2及其植物表达载体和构建方法。

背景技术

盐胁迫是影响植物生长发育的重要胁迫因子，是限制我国盐碱地高效利用的关键因子。因此开展抗盐性的研究成为热点领域。荻(Miscanthus sacchariflora)为禾本科(Gramineae)芒属(Miscanthus Anderss.)植物，作为原产我国的重要能源植物，具有很高的开发利用价值，然而由于目前生产上常用的奇岗(Miscanthus x giganteus)等材料的耐盐性相对有限，极大影响了其在盐碱地的栽培应用。鉴于抗盐性是是一个多基因控制的数量性状，杂交育种等常规育种方法效率低。已有研究表明，转高效抗盐基因的分子育种对提高植物抗盐性有积极作用。

氢离子焦磷酸酶(H⁺-PPase，VP)是位于液泡膜上的一种质子泵，通过调节细胞内外的氢离子转运，改变其酸碱度，为其他物质运输提供动力，从而影响植物的生长发育。目前从植物中鉴定到两个类型：钾离子敏感性VP1和钾离子不敏感型VP2，大量的研究集中在VP1基因上，其通过建立的氢离子梯度，诱导钠氢反向转运蛋白将钠离子导入液泡，缓解钠毒害，提高抗盐性。而钾离子不敏感型VP2的功能尚不明确，研究发现拟南芥VP2定位于高尔基体，可能参与高尔基体上质子转运，进而可以起到缓解植物在盐胁迫下的受害程度的作用。

在植物的遗传转化途径中，农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，其中有效的植物表达载体至关重要。将抗盐基因构建植物表达载体，用于农杆菌介导的植物遗传转化，可获得具有抗盐特性的新种质。对于优良作物新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。

发明内容

针对背景技术提出的解决提高荻耐盐性的问题，本发明的目的在于提供一个新的荻抗盐基因MsVP2，该基因的序列为SEQ ID NO.1。

本发明的另一目的在于该抗盐基因MsVP2的植物表达载体。

本发明所构建的植物表达载体可确定MsVP2的抗盐功能，为植物品种改良提供优异的抗盐基因。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

荻抗盐基因MsVP2，该基因的序列为SEQ ID NO.1。

荻抗盐基因MsVP2的植物表达载体，由本发明所述的荻抗盐基因MsVP2(序列为SEQ ID NO.1)与中间表达载体pEarleyGate103构成。

上述的荻抗盐基因MsVP2的植物表达载体，是由Sal I和Not I双酶切MsVP2后插入到gateway入门载体pENTR1A，经NsiI单酶切线性化与pEarleyGate103表达载体质粒进行重组反应得到。

荻抗盐基因pEarleyGate103植物表达载体，其构建方法如下：

1)荻抗盐基因MsVP2的克隆

以提取的荻幼嫩叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，设计引物扩增MsVP2基因，

上游引物MsVP2-F：5′-ATGATGGAAGAAGACGTGGA-3′

下游引物MsVP2-R：5′-CAAGAATATTGGTGCCATGACC-3′

以反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到pMD19-TSimple载体，转化TOP10感受态细胞，测定的序列为SEQ ID NO.1；

2)植物表达载体pEarleyGate103-MsVP2的构建

设计引物以荻cDNA为模板，用高保真酶进行PCR反应，在MsVP2基因的上游和下游分别引入Sal I和Not I酶切位点，

上游引物MsVP2-gateway-F：5′-GCGTCGACATGATGGAAGAAGACGT-3′

下游引物MsVP2-gateway-R：5′-TTGCGGCCGCGACAAGAATATTGGTGCCAT-3′

PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，Sal I和Not I双酶切的MsVP2片段与Sal I和Not I双酶切的pENTR1A连接，转化，提取的阳性质粒经NsiI单酶切线性化，与pEarleyGate103载体质粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒，电泳检测并测序验证为SEQ ID NO.1，植物表达载体pEarleyGate103-MsVP2构建成功。