[发明专利]鳜鱼弹状病毒的检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.鳜鱼弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： 

(1)5×逆转录缓冲液100μL； 

(2)逆转录酶25μL； 

(3)随机引物25μL； 

(4)2×聚合酶链式反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分： 

(5)检测引物的设计合成：根据GenBank中发布的鳜鱼弹状病毒的基因序列，在其保守序列设计一对特异性检测引物，上游引物P1：5’-ATAAGGGTAGTTGAGAAGAAG-3’，下游引物P2：5’-CTTCTTGTTGCTCTTCTTAAA-3’，浓度为10μM； 

(6)Taq酶         5U/μL； 

(7)灭菌的ddH₂O   1.0mL； 

(8)阳性对照液：提取鳜鱼弹状病毒总RNA，逆转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，以Pl、P2为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物连接到pMD18-T载体，以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照； 

(9)阴性对照液：以ddH₂O作为阴性对照。 

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，采用试剂盒检测鳜鱼弹状病毒的方法为： 

(1)待测样品RNA的提取：解剖待检测的鱼样品，取肝、脾、肾等组织进行匀浆，采用传统的Trizol法或者商业化的RNA提取试剂盒提取RNA，用ddH₂O溶解，即为试验用RNA模板； 

(2)逆转录合成cDNA：取待测样品的RNA模板7μL，加入PCR反应管中，再加入5×逆转录缓冲液2μL、逆转录酶0.5μL、随机引物0.5μL，反应总体积10μL，充分混匀后，置于PCR仪上，37℃15min逆转录反应，85℃5sec灭活逆转录，得到cDNA产物； 

(3)PCR扩增：采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟； 然后94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环35次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存； 

(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小； 

(5)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在372bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为鳜鱼弹状病毒阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的鳜鱼弹状病毒。