[发明专利]鳜鱼弹状病毒的检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于水产动物病原的检测与诊断技术领域，涉及一种鳜鱼弹状病毒的检测方法，特别是一种采用逆转录-聚合酶链式反应(简称RT-PCR)技术检测鳜鱼弹状病毒的方法。 

背景技术

近年来，广东省的佛山、中山，山东的济宁以及湖北等地的乌鳢、鳜鱼、加州鲈鱼养殖场爆发大规模的流行性疾病，造成巨大的经济损失。实验室从细菌学和病毒学两方面对患病鱼进行检测分析，确认引起这些养殖鱼类暴发性死亡的疾病为弹状病毒病，其病原为鳜鱼弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus，SCRV)。 

弹状病毒(Rhabdovirus)是一种单股不分节段的负链RNA病毒，病毒粒子大小为(100-430)nm×(45-100)nm，形态似棒状或子弹状。弹状病毒种类较多，包括175种以上的成员，可感染脊椎动物、无脊椎动物及植物。鱼类弹状病毒因感染宿主广、毒株种类多、毒力强，严重危害各种淡水和海水鱼。迄今报道感染鱼类的弹状病毒已有二十多种，其中危害较大的有鲤春病毒血症病毒(SVCV)。病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、牙鲆弹状病毒(HRV)和鳜鱼弹状病毒(SCRV)等。通过调查了解发现，自然感染鳜鱼弹状病毒的乌鳢、鳜鱼、加州鲈鱼死亡率高达90％。为了及早发现养殖鱼类是否被SCRV感染，有必要建立一种快速、准确、灵敏的检测方法。 

传统病毒病的诊断需要进行病毒分离，细胞培养，电镜观察以及免疫检测等方法，缺乏对病毒进行快速、准确、敏感的检测方法。PCR方法具有操作简单、特异、快速、敏感等优点，正逐步应用于病原微生物的检测与研究中。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种鳜鱼弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应检测方法，能快速、高效地用于鳜鱼弹状病毒的检测。 

鳜鱼弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应检测试剂盒，所述试剂盒包括： 

(1)5×逆转录缓冲液100μL； 

(2)逆转录酶25μL； 

(3)随机引物25μL； 

(4)2×聚合酶链式反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分： 

(5)检测引物的设计合成：根据GenBank中发布的鳜鱼弹状病毒的基因序列，在其保守序列设计一对特异性检测引物，上游引物P1：5’-ATAAGGGTAGTTGAGAAGAAG-3’，下游引物P2：5’-CTTCTTGTTGCTCTTCTTAAA-3’，浓度为10μM； 

(6)Taq酶         5U/μL； 

(7)灭菌的ddH₂O   1.0mL； 

(8)阳性对照液：提取鳜鱼弹状病毒总RNA，逆转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，以Pl、P2为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物连接到pMD18-T载体，以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照； 

(9)阴性对照液：以ddH₂O作为阴性对照。 

采用试剂盒检测鳜鱼弹状病毒的方法为： 

(1)待测样品RNA的提取：解剖待检测的鱼样品，取肝、脾、肾等组织进行匀浆，采用传统的Trizol法或者商业化的RNA提取试剂盒提取RNA，用ddH₂O溶解，即为试验用RNA模板； 

(2)逆转录合成cDNA：取待测样品的RNA模板7μL，加入PCR反应管中，再加入5×逆转录缓冲液2μL、逆转录酶0.5μL、随机引物0.5μL，反应总体积10μL，充分混匀后，置于PCR仪上，37℃15min逆转录反应，85℃5sec灭活逆转录，得到cDNA产物； 

(3)PCR扩增：采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环35次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存； 

(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；