[发明专利]黄曲霉毒素B1的实时定量PCR检测方法

权利要求书

1.黄曲霉毒素B₁的实时定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将AFB₁的生物素化的适配体与互补单链DNA链进行杂交，得到混合溶液；(2)将混合溶液加入到吸附或交联有链霉亲和素的PCR管中；(3)将待检测的样品加入到PCR管中，释放出互补单链DNA链；(4)用固定在PCR管表面的互补单链DNA建立RT-qPCR定量检测体系进行RT-qPCR扩增反应；(4)根据扩增结果，对样品中AFB₁的含量进行定量分析；

其中，所述的AFB₁的生物素化的适配体的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其3′端连有生物素；

所述的互补单链DNA的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；

步骤(2)所述链霉亲和素的浓度为2.5ng mL^-1；

步骤(1)所述生物素化的适配体浓度为5.0nM；

步骤(1)将AFB₁的生物素化的适配体与互补单链DNA链按照1:1的体积比进行杂交；

步骤(4)RT-qPCR定量检测体系中互补单链DNA浓度范围为1×10^-4到10nM；

步骤(4)中所述的RT-qPCR定量检测体系按照以下方式建立：50μL PCR反应体系由以下部分组成：浓度范围1×10^-4到10nM之间的互补单链DNA为5μL，10μM上、下游引物分别添加2μL，25μLPremix Ex1μL 50×ROX Reference Dye II和15μL水；所述上、下游引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；

所述的RT-qPCR反应参数如下：预变性30s 95℃,变性40个循环5s 95℃,退火34s 60℃。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：根据扩增结果，建立黄曲霉毒素B₁与扩增循环数之间的线性关系，对黄曲霉毒素B₁的含量进行定量分析。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述线性关系的线性回归方程为：Ct＝3.816lg C+24.622，其中，Ct表示循环数，C表示AFB₁的浓度。