[发明专利]黄曲霉毒素B1的实时定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种黄曲霉毒素B₁的检测方法，尤其涉及一种基于适配体的生物传感器结合实时定量PCR的黄曲霉毒素B₁的检测方法，属于黄曲霉毒素B₁的定量检测领域。

背景技术

黄曲霉毒素是最重要的霉菌毒素之一，是由包括黄曲霉和寄生曲霉的霉菌产生的有毒次级代谢产物，在黄曲霉毒素的几种亚型中(B₁,B₂,G₁,G₂和M₁)，AFB₁的毒性最强，因此AFB₁被世界卫生组织(WHO)国际癌症研究机构指定为主要致癌物。由于霉菌毒素对动物和人类产生的毒性效应，霉菌毒素污染在饲料和食品安全领域已经引起了全球的广泛关注。

AFB₁可以直接污染食品(例如在高温潮湿环境下谷类，坚果)或者间接污染饲料，动物采食AFB₁后，在奶中产生代谢物。为了阻止由于污染的饲料和食品的召回带来的食品安全恐慌和经济损失，很多国家对黄曲霉毒素进行了限量。不同食品AFB₁的限量范围为0.05-20ng mL^-1。对于AFB₁低限量，高出现率和其剧毒性表明快速，灵敏和特异性检测方法甚至定量追踪AFB₁的水平是十分必要的。

现有的定量检测AFB₁的方法主要有TLC、HPLC和LC结合MS技术。然而，仪器法需要复杂的前处理，专业的操作人员和昂贵的仪器设备，这些要求限制了仪器法的应用。因此，一些快速筛选方法如ELISA，免疫传感器和SPR的方法也得到了广泛的应用。但是在运输和贮存过程中由于抗体的稳定性难以保证，尤其是在受控环境中时，限制了这类方法的应用。与抗体有着类似功能的适配体，具有低价格，高稳定性，易修饰和易合成等优点，可以重复使用和长时间保存。除此之外，适配体可以作为PCR扩增的模板很大 程度上提高检测灵敏度，产生的荧光信号作为定量检测的指示器。但是，基于适配体传感器的霉菌毒素研究主要集中于OTA和FB₁，可用于霉菌毒素的适配体是十分有限的，有待改进。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于适配体的生物传感器的黄曲霉毒素B₁的实时定量PCR检测方法，该检测方法具有线性范围好、灵敏度高、选择性好、稳定性强等优点。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种检测黄曲霉毒素B₁的实时定量PCR检测方法，该方法包括以下步骤：

本发明公开了一种黄曲霉毒素B₁(AFB₁)的实时定量PCR检测方法，该方法利用黄曲霉毒素B₁适配体对黄曲霉毒素B₁进行识别，利用实时定量PCR对黄曲霉毒素B₁适配体的互补DNA链进行扩增作为信号输出，从而实现对黄曲霉毒素B₁的识别和检测，所述实时定量PCR检测方法包括以下步骤：

(1)将AFB₁的生物素化的适配体与互补单链DNA链进行杂交，得到混合溶液；(2)将混合溶液加入到PCR管中；(3)将待检测的样品加入到PCR管中；与适配体杂交的互补单链DNA链与待检测的样品中的AFB₁相结合，释放出互补单链DNA链；去除PCR管中适配体与黄曲霉毒素B₁的复合物以及释放出的互补DNA链；(4)向PCR管中加入特异性的上下游引物，以固定在PCR管表面的互补单链DNA为模板建立RT-qPCR定量检测体系，进行RT-qPCR扩增反应；(4)根据扩增结果，建立黄曲霉毒素B₁与扩增循环数(Ct值)之间的线性关系，对黄曲霉毒素B₁的含量进行定量分析。

本发明中所述的“AFB₁的生物素化的适配体”的核苷酸序列优选为 SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，在其3′端连有生物素。

本发明中所述的“互补单链DNA链”的核苷酸序列可以是任何一种能够与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列进行互补或杂交的序列；本领域技术人员根据SEQ ID No.1所示的核苷酸序列很容易设计得到，优选为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。