[发明专利]人工诱导四倍体鲫鱼细胞系及其培养方法和应用

权利要求书

1.一种人工诱导四倍体鲫鱼细胞系，其特征在于：所述人工诱导四倍体鲫鱼细胞系为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心且保藏号为CGMCC No.9155的四倍体鲫鱼细胞系。

2.一种体外诱导二倍体鲫鱼细胞多倍化的方法，包括以下步骤：首先，以体外培养的二倍体鲫鱼细胞为原材料，待细胞生长密度达到80％～90％融合度时，再用抑制剂SP600125加入细胞培养液中进行处理，SP600125的处理浓度为50～100μM之间，处理时间在48h以上，然后换成不含SP600125的常规培养基培养，培养传一代后再进行流式分析，利用流式细胞仪测定DNA含量，同时利用细胞染色体制备工艺检测处理培养后鲫鱼细胞的染色体倍性，经人工诱导与分选纯化得到了体外人工诱导的四倍体鲫鱼细胞系。

3.根据权利要求2所述的体外诱导二倍体鲫鱼细胞多倍化的方法，其特征在于，所述二倍体鲫鱼细胞的体外培养的具体操作包括：

(1)取尾鳍处理：以鲫鱼为对象，并从鲫鱼的尾鳍中剪取小块鳍条置于缓冲液中，对其进行反复漂洗；将漂洗后的鳍条剪碎至能在显微镜下看到游离的单个细胞即可，然后用缓冲液反复清洗，离心沉淀；

(2)胰酶消化处理：向上述离心沉淀后的沉淀物中加入胰酶进行消化处理，至显微镜下观察有大量单细胞后，加含胎牛血清培养基终止反应，离心去上清，继续加入培养基，吸打混匀后将其均匀地铺于培养皿中，培养箱中培养后再加入新鲜培养基，第二天即在组织块周围有单层细胞长出，几天后将获得的单层细胞再次用胰酶进行消化处理，计数后直接接种于培养皿中，得到稳定的二倍体鲫鱼细胞。

4.根据权利要求3所述的体外诱导二倍体鲫鱼细胞多倍化的方法，其特征在于，所述取尾鳍处理的具体操作步骤包括：以鲫鱼为对象，先用酒精溶液消毒鲫鱼的尾鳍，然后用解剖剪从尾鳍的尾尖部剪下小块鳍条后置于含有磷酸缓冲液的培养皿中；在无菌操作台中，再用解剖镊子夹取该鳍条放到盛有酒精溶液的培养皿中进行漂洗，漂洗时间控制在1分钟以下；然后用解剖镊子夹取漂洗后的鳍条放入含磷酸缓冲液的EP管中，继续反复漂洗多次，最后一次漂洗后EP管中保留一定量磷酸缓冲液；将漂洗后的鳍条剪碎至能在显微镜下看到游离的单个细胞即可，然后用缓冲液反复清洗，离心沉淀。

5.根据权利要求3所述的体外诱导二倍体鲫鱼细胞多倍化的方法，其特征在于，所述胰酶消化处理的具体操作步骤包括：向所述沉淀物中先加入适量的0.25wt％的胰酶，消化处理15min～30min，显微镜下观察有大量单细胞后，加入10vol％的胎牛血清培养基终止反应；离心去上清，继续加入适量的DMEM培养基，吸打混匀后将其均匀地铺于预先用明胶包被的培养皿中；再置于28℃、5％CO₂的培养箱中培养至少30min，然后再加入新鲜的DMEM培养基，第二天即在组织块周围有单层细胞长出，至少7天后将获得的单层细胞再次用0.05wt％的胰酶进行消化处理，计数后直接接种于明胶包被的培养皿中，再置于培养箱中继续培养即可。

6.根据权利要求2～5中任一项所述的体外诱导二倍体鲫鱼细胞多倍化的方法，其特征在于，所述体外培养的培养条件包括：细胞置于28℃、5％CO₂的培养箱中培养，体外培养基为DMEM培养基，其中含有10vol％的胎牛血清、1vol％的丙酮酸钠、1vol％的非必需氨基酸、1vol％的L-谷氨酰胺、0.1vol％的β-巯基乙醇和1vol％的青霉素/链霉素。

7.根据权利要求2～5中任一项所述的体外诱导二倍体鲫鱼细胞多倍化的方法，其特征在于，在所述抑制剂SP600125处理并进行传代的培养细胞中，待细胞生长密度达到80％～90％融合度时，再次加入50～100μM SP600125进行处理48h以上，然后替换成不含抑制剂SP600125培养基培养12h后进行传代；按如此循环间隔处理模式培养处理5代以上，最后通过流式细胞仪进行流式分选，即得到体外诱导的四倍体鲫鱼细胞；再将该四倍体鲫鱼细胞继续培养传代，细胞稳定生长后再进行流式分选，直至得到纯净的四倍体鲫鱼细胞系。

8.根据权利要求7所述的体外诱导二倍体鲫鱼细胞多倍化的方法，其特征在于，所述流式分选的检测过程包括：利用流式细胞仪测定DNA含量以及利用细胞周期分析检测分选后四倍体鲫鱼细胞的增殖特性。

9.一种如权利要求1所述的或者如权利要求2～8中任一项方法获得的人工诱导四倍体鲫鱼细胞系的应用，其特征在于：通过诱导多能干细胞方法或者采用细胞核移植相结合的方法将所述四倍体鲫鱼细胞系的细胞核移植到去核卵中，用于快速高效地创制四倍体鱼。