[发明专利]人工诱导四倍体鲫鱼细胞系及其培养方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种人工诱导鲫鱼细胞系及其培养方法和应用，尤其涉及一种人工诱导四倍体鲫鱼细胞系及体外诱导二倍体鲫鱼细胞多倍化方法和相关应用。

背景技术

自然界中生物通常以二倍体形式存在。然而，许多生物在其进化史上存在着多倍化事件，研究显示，脊椎动物至少经历了两轮四倍体化的过程。目前认为，通过染色体加倍来形成新的物种是一条可行的进化途径。多倍体育种作为一种重要的遗传育种和性状改良方法，它可以获得三套或者三套以上完整染色体组，从而使后代可能在生长速度、抗逆性、抗病性等方面表现出品种优势，经济效益显著。

杂交育种是培育多倍体鱼的重要途径，但大多数杂交后代不育或育性低下，同时鱼类性成熟时间长、繁殖周期长，这严重制约了鱼类多倍体的培育。

如何利用现代生物学手段和方法来建立快速高效的新型多倍体诱导技术体系，就成为本领域技术人员面临和需要解决的技术难题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种可用于进行细胞学、发育遗传学、免疫学和遗传育种等领域，且具有重要科研价值和应用价值的人工诱导四倍体鲫鱼细胞系，还相应提供一种流程简洁、可操作性强、诱导效率高的体外诱导二倍体鲫鱼细胞多倍化的方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种人工诱导四倍体鲫鱼细胞系，所述人工诱导四倍体鲫鱼细胞系为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心且保藏号为CGMCC No.9155的四倍体鲫鱼细胞系。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种体外诱导二倍体鲫鱼细胞多倍化的方法，包括以下步骤：首先，以体外培养的二倍体鲫鱼细胞为原材料，待细胞生长密度达到80％～90％融合度时，再用JNK信号通路的抑制剂SP600125(anthrapyrazolone，C₁₄H₈N₂O)加入细胞培养液中进行处理(即加入培养液中进行细胞培养)，SP600125的处理浓度为50～100μM(优选接近100μM)，处理时间在48h以上，然后换成不含SP600125的常规培养基培养，培养(一般不少于12h)传一代后再进行流式分析，利用流式细胞仪测定DNA含量，同时利用细胞染色体制备工艺检测处理培养后鲫鱼细胞的染色体倍性，结果表明鲫鱼细胞发生G₂/M期阻滞，经人工诱导与分选纯化得到了体外人工诱导的四倍体鲫鱼细胞系。

上述的体外诱导二倍体鲫鱼细胞多倍化的方法，优选的，所述二倍体鲫鱼细胞的体外培养的具体操作包括：

(1)取尾鳍处理：以鲫鱼为对象，并从鲫鱼的尾鳍中剪取小块鳍条置于缓冲液中，对其进行反复漂洗；将漂洗后的鳍条剪碎至能在显微镜下看到游离的单个细胞即可，然后用缓冲液反复清洗，离心沉淀；

(2)胰酶消化处理：向上述离心沉淀后的沉淀物中加入胰酶进行消化处理，至显微镜下观察有大量单细胞后，加含胎牛血清培养基终止反应，离心去上清，继续加入培养基，吸打混匀后将其均匀地铺于培养皿中，培养箱中培养后再加入新鲜培养基，第二天即在组织块周围有单层细胞长出，几天后将获得的单层细胞再次用胰酶进行消化处理，计数后直接接种于培养皿中，得到稳定的二倍体鲫鱼细胞系。

上述的体外诱导二倍体鲫鱼细胞多倍化的方法，更优选的，所述取尾鳍处理的具体操作步骤包括：以鲫鱼为对象，先用酒精溶液消毒鲫鱼的尾鳍，然后用解剖剪从尾鳍的尾尖部剪下小块鳍条后置于含有磷酸缓冲液(PBS)的培养皿中；在无菌操作台中，再用解剖镊子夹取该鳍条放到盛有酒精溶液的培养皿中进行漂洗，漂洗时间控制在1分钟以下；然后用解剖镊子夹取漂洗后的鳍条放入含磷酸缓冲液的EP管中，继续反复漂洗多次，最后一次漂洗后EP管中保留一定量磷酸缓冲液；将漂洗后的鳍条剪碎至能在显微镜下看到游离的单个细胞即可，然后用缓冲液反复清洗，离心沉淀。