[发明专利]一种翅柄铁线蕨快速繁殖的方法

权利要求书

1.一种翅柄铁线蕨快速繁殖的方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤：

1)外植体的选取：取2cm长的根状茎茎尖，去掉杂质及茎尖周围的绒毛等附属物；

2)外植体消毒：将上述茎尖放入盛有自来水的20-25KHz超声波清洗机中保持温度30-35℃处理30-45min，然后以自来水冲洗10-20min；随后在超净工作台上以70-75％的酒精消毒25-35秒，0.02％升汞溶液中处理5-7分钟，然后以无菌水冲洗4-5遍，置于无菌培养皿备用；

3)初始诱导培养：将灭菌后外植体两端各剪去2-3mm，茎尖按末端向下插入初始诱导培养基中培养，培养条件为光强1000-2500Lx、光周期5-8h/d,温度25℃±2℃；培养4-6d后将其中未污染的外植体茎尖转接到新的初始诱导培养基中，并继续培养12-18d至新芽长出；所述的初始诱导培养基组成为：MS+6-BA0.1-0.2mg/L+NAA0.01-0.02mg/L；

4)愈伤组织诱导：取初始诱导培养中的芽，放入愈伤组织诱导培养基中培养15-20d，条件为暗培养，温度20℃±2℃；所述愈伤组织培养基为：MS+6-BA0.5-2.0mg/L+NAA0.02-0.5mg/L+PVP5-10mg/L；

5)分化和增殖培养：将透明无色的愈伤组织块放入分化培养基中培养20-25d，增殖产生大量丛生苗，培养条件为光强1800-2500Lx、光周期8-10h/d,温度25℃±2℃；所述分化和增殖培养用培养基为：WPM+6-BA0.1-0.5mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L；

6)生根培养：将5)步骤中的丛生苗切割成单个，转移至生根培养基中培养15-20d后生根，培养条件为光强1800-2500Lx、光周期8-10h/d,温度25℃±2℃；所述生根用培养基为：1/2MS+IBA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L；

7)炼苗和移栽：将有生根的翅柄铁线蕨幼苗的培养基瓶盖打开，室温下炼苗5-8d后，取出幼苗，洗去根部培养基，移栽装有河沙和蛭石基质的苗床上，保持温度20-25℃，湿度85％-95％，适当遮荫即可；

所述的WPM培养基配方为：大量元素：硝酸铵NH4NO₃400mg/L，硫酸钾K₂SO₄900mg/L，磷酸二氢钾KH₂PO₃170mg/L，硫酸镁MgSO₄·7H₂O370mg/L；钙盐：氯化钙CaCl₂·2H₂O96mg/L；四水合硝酸钙Ca(NO₃)₂·4H₂O556mg/L；微量元素：硼酸H₃BO₃6.2mg/L，硫酸锰MnSO₄·4H₂O22.5mg/L，硫酸锌ZnSO₄·7H₂O8.6mg/L，钼酸钠Na2MoO₄·2H₂O0.25mg/L，硫酸铜CuSO₄·5H₂O0.25mg/L；铁盐：乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA37.3mg/L，硫酸亚铁FeSO4·7H₂O27.8mg/L；有机酸：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L；

所述的MS培养基配方为：大量元素：硝酸钾KNO₃1900mg/L，硝酸铵NH₄NO₃1650mg/L，磷酸二氢钾KH₂PO₃170mg/L，硫酸镁MgSO4·7H₂O370mg/L；钙盐：氯化钙CaCl₂·2H₂O440mg/L；微量元素：碘化钾KI0.83mg/L，硼酸H₃BO₃6.2mg/L，硫酸锰MnSO4·4H₂O22.3mg/L，硫酸锌ZnSO4·7H₂O8.6mg/L，钼酸钠Na2MoO4·2H₂O0.25mg/L，硫酸铜CuSO4·5H₂O0.025mg/L，氯化钴CoCl₂·6H₂O0.025mg/L；铁盐：乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA37.25mg/L,硫酸亚铁FeSO4·7H₂O27.85mg/L；有机酸：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L；蔗糖30g/L，琼脂粉7g/L，pH为5.7；

所述的1/2MS培养基配方为：大量元素：硝酸钾KNO₃950mg/L，硝酸铵NH₄NO₃825mg/L，磷酸二氢钾KH₂PO₃85mg/L，硫酸镁MgSO4·7H₂O185mg/L；余同上述MS培养基；

所述的6-BA为6-苄氨基嘌呤；

所述的NAA为α-萘乙酸；

所述的IBA为吲哚-3-丁酸；

所述的PVP为聚乙烯吡咯烷酮。