[发明专利]一种来源于鸡肠道的雌马酚产生梭菌C1-6及应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种雌马酚产生梭菌，特别涉及一种来源于鸡肠道的雌马酚产生梭菌C1-6的分离鉴定及应用。

(二)背景技术

肠道内的微生物复杂多样，它们共同构成了一个动态平衡的微生态系统，然而同种动物消化道的不同位置所含微生物的数量和种类存在差异。对家禽肠道微生物的研究，目前主要集中在盲肠部位。有学者曾运用分子技术分析发现，鸡盲肠内的微生物最为丰富，但问题是目前只有约10％的微生物是已知的物种，这使我们研究肠道微生物种类和作用产生局限性。另外，Zhu等人(Appl Environ Microbiol,2002,68,1:124-37)利用从鸡盲肠内容物中筛选到的1656条16S rRNA序列，分析发现在鸡盲肠微生物中梭菌属细菌是数量上最占优势的细菌之一，其他大部分都是未知菌种，还需进一步研究。

梭状芽孢杆菌由硬壁菌门中的革兰式阳性杆状细菌组成。大部分的梭状芽孢杆菌都能产生内孢子，因此具有在恶劣条件下存活的生态优势。尽管有些种类的梭菌会产生毒素类物质且具有致病性，但大部分的梭菌与宿主之间维持着共生关系。其中梭菌属Ⅹ Ⅳa簇和梭菌属Ⅳ簇包含了多种梭形菌，它们构成了肠道微生物中总菌的10-40％，且能够产生大量不同的酶类来降解宿主无法消化的各种多糖和寡糖类物质，这些复合物降解之后的产物包括乙酸，丙酸和酪酸。另外最新研究发现梭菌属Ⅹ Ⅳa簇和Ⅳ簇细菌在宿主免疫系统的调控中发挥着重要作用，一个由梭菌属Ⅹ Ⅳa簇和Ⅳ簇中的46株梭菌组成的混合剂，具有诱导大肠上皮淋巴细胞(intraepithelial lymphocytes，IELs)T细胞受体和免疫球蛋白A(IgA)分泌细胞积累的作用，而且由这46株梭菌组成的混合剂还能影响CD4调节T细胞的数量和功能。因此分离培养鸡肠道内的梭状芽孢杆菌，进一步研究其功能显得尤为重要。

虽然目前已有很多分子生物学技术用于肠道微生物的研究，比如基于16S rRNA基因的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳/温度梯度凝胶电泳技术(DGGE/TGGE)、原位杂交技术(FISH)、末端限制性片断长度多态性分析(T-RFLP)以及实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR)，但传统的体外纯培养仍是研究肠道微生物的一种重要手段。目前，往往是将两种方法结合起来使用。首先，利用不同的培养条件在体外纯培养不同的细菌，再结合现有分子水平鉴定方法鉴定所分离得到的菌株种类，此方法快速准确又能得到纯培养细菌，具有广泛的应用前景。

对现有文献和专利进行检索发现，目前用于动物生产和饲料添加剂开发等的主要是丁酸梭菌。本实验利用NEOGEN提供的梭菌培养基，通过分离筛选从鸡盲肠内容物中分离到了一株新的梭状芽胞杆菌，作为影响新生小鸡肠道菌群定植的干涉组，为进一步研究其对小鸡生长及健康状态的影响做准备，将来也可为研制禽类微生态制剂、饲料添加剂等提供理论基础和科学依据。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种新的雌马酚产生梭菌(Clostridium sp.)C1-6及其在催化大豆素产生S-雌马酚中的应用，以及其在小鸡饲养过程中促生长和抑制沙门氏菌定殖的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新的雌马酚产生梭菌(Clostridium sp.)C1-6，保藏编号为CGMCC No.9123，保藏日期2014年5月4日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明还提供一种所述雌马酚产生梭菌C1-6在转化大豆素制备S-雌马酚中的应用，具体为：将雌马酚产生梭菌C1-6经扩大培养获得的种子液以体积浓度5％的接种量接种至含大豆素的BHI液体培养基，在厌氧条件下，37℃培养48h后，将培养液分离纯化(优选将培养液用乙酸乙酯进行液相萃取，取萃取层检测S-雌马酚含量)，获得S-雌马酚；所述BHI培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L、脱水小牛脑浸粉12.5g/L、脱水牛心浸粉5.0g/L、氯化钠5.0g/L、葡萄糖2.0g/L、磷酸氢二钠2.5g/L，溶剂为水，pH值为7.0；所述大豆素的初始浓度为50μg/ml。