[发明专利]运动发酵单胞菌RED重组系统表达质粒及其构建方法与应用

权利要求书

1.一类能在运动发酵单胞菌中应用的RED重组系统表达质粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED和pSUZM3a-RED，包含运动发酵单胞菌内源性基因启动子、筛选标记基因和RED重组系统基因（exo、bet、gam）。

2.根据权利1所述的质粒，其特征在于：

1）pSUZM1a-RED包含运动发酵单胞菌染色体上的复制起点oriC、质粒pUC18的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、来自运动发酵单胞菌的组成型基因启动子-丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc、来自质粒pKD46的RED重组系统基因；

2）pSUZM2a-RED包含运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401的复制蛋白序列、质粒pUC18的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、来自组成型基因启动子-丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc、来自质粒pKD46的RED重组系统基因；

3）pSUZM3a-RED包含运动发酵内源性质粒pZZM402的复制蛋白序列、质粒pUC18的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、组成型基因启动子-丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc、来自质粒pKD46的RED重组系统基因。

3.权利2所述的载体的构建方法，包括如下步骤：

1）分别以运动发酵单胞菌表达质粒pSUZM1a（含有运动发酵单胞菌染色体复制起点oriC、质粒pUC18上的复制起点、以及来自于运动发酵单胞菌的组成型基因启动子Ppdc）、pSUZM2a（含有运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401的复制起点和DNA复制酶基因序列、质粒pUC18的复制起点、以及来自于运动发酵单胞菌的组成型基因启动子Ppdc）、pSUZM3a（含有运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM402的复制起点和DNA复制酶基因序列、质粒pUC18的复制起点、以及来自于运动发酵单胞菌的组成型基因启动子Ppdc）为模板，用以下引物5’-GAGCAATGGCGATGAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3’和5’-CAGTTTCAGTATTAATATCCATTGCTTACTCCATATAT-3’，进行PCR扩增，获得载体骨架片段A(pSUZM1a)、B(pSUZM2a)和C（pSUZM3a）；

2)以pKD46质粒为模板，用以下引物5’- ATATATGGAGTAAGCAATGGATATTAATACTGAAACTG-3’和5’- CCCACTGCAAGCTACCTTCATCGCCATTGCTC -3’进行PCR扩增，获得基因片段RED；

(3)将载体骨架片段A、B和C与基因片段RED分别经电泳凝胶回收后等摩尔混合，混合片段用T4 DNA聚合酶进行处理，然后进行退火反应重组，转化大肠杆菌，获得重组质粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED和pSUZM3a-RED。